NQO1基因多态性与肺癌遗传易感性

癌症 2000年第5期第19卷 基础研究

作者：林月好　卢锡林　邵明　梁伊仁　李幼娟

单位：林月好　梁伊仁　李幼娟(中山医科大学肿瘤防治中心，广东 广州510060)；卢锡林　邵明(中山医科大学附属第一医院神经学教研室，广东 广州510080)

关键词：肺肿瘤；醌氧化还原酶；基因；多态性；遗传易感性

　　【摘要】目的：探讨依赖还原型辅酶I/II醌氧化还原酶基因cDNA609位C→T点突变所致的基因多态性是否与肺癌遗传多态性有关。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）的分析方法分析了95例肺癌病人与136例健康成人对照组NQO1的基因多态性。结果：T等位基因频率在肺癌组和对照组分别为54％、43％，两组有显著差异（P=0.024）。基因型分布在肺癌组和对照组之间差异显著（p=0.008）。T/C和T/T基因型携带者患肺癌的危险性分别是野生型纯合子（C/C）的2.949倍（95％可信限：1.426～6.096）与3.106倍（95％可信限：1.284～9.514）。结论：本研究结果提示NQO1基因cDNA609突变T等位基因可能是肺癌发生的危险性因素，与肺癌的遗传易感性有关。

　　中图分类号：R96；R979.1；R739.63文献标识码：A文章编号：1000－467X(2000)05－0450－03

NAD(P)H：quinone oxidoreductase gene polymorphism and susceptibility of lung cancer

LIN Yue-hao, LU Xi-lin, SHAO Ming, et al.

　　（Cancer Center， Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060,P.R.China）

　　【 Abstract】 Objectives： To investigate whether lung cancer is associated with genetic polymorphism of NQO1 gene (NAD(P) H： quinone oxidoreductase gene)caused by the point mutation of cDNA 609 C to T. Methods： The polymorphism of NQO1 gene was analyzed in 95 patients with lung cancer and 136 unrelated healthy adult individuals by utilizing polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay. Results： In this study, the frequencies of T allele were 54％ and 43％ in the lung cancer group and the health control group respectively, which was significantly different between the two groups(P=0.024). The allelic frequency of the mutant T allele was significantly higher in the lung cancer patients as compared to controls. There was a significant difference in the overall genotypical distribution between the patients and the controls (P=0.008). The risk of suffering from lung cancer was increased 2.949 times in the individuals with T/C genotype (95％ CI： 1.426～ 6.096) and 3.01 times in the individuals of T/T genotype of NQO1 gene (95％ CI： 1.284～ 9.514). Conclusion： This study suggested that the cDNA609 T allele of NQO1 gene might be the risk factor of lung cancer, which could be associated with genetic susceptibility of lung cancer.

　　Key works： Lung neoplasms; NAD(P)H： quinone oxidoreductase gene; Polymorphism

　　肿瘤的遗传易感性与环境因素相互作用的关系日益受到人们的关注。研究表明，与毒素代谢相关的酶的遗传多态性与肿瘤的遗传易感性密切相关。依赖还原型辅酶I(II)醌氧化还原酶[NAD(P)H：quinone oxidoreductase,NQO1，EC1.6.99.2],又称DT-硫辛酰胺脱氢酶(DT-diaphorase),是一种黄素酶，它催化醌双电子还原反应,对醌及其衍生物有解毒作用^[1]。而醌是一种有毒的化合物，能诱发哺乳动物细胞癌变、突变和坏死，因此，该酶与肿瘤的关系已引起了人们的重视。我们应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术对编码该酶的一段基因的多态性在一组肺癌病人中进行了分析，旨在探讨其基因多态性与肺癌的关系。

表1　NQO1等位基因与肺癌的关系

　　1资料与方法1.1研究对象

　　95例经中山医科大学肿瘤医院诊断的肺癌病人，年龄37～76岁(男77例，女18例),其中腺癌34例，鳞癌49例，小细胞未分化癌12例。136例健康成人(男66例，女70例)，分别来自门诊健康查体，年龄40～72岁。

　　1.2研究方法

　　抽静脉血提取DNA，利用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）技术,采用陈氏报道的方法^[3，4]。根据NQO1基因cDNA ₆₀₉位点相当于NQO1基因全序列第6号外显子40位点设计引物，其序列如下：NQO1 F：5'-AAGCCCAGACCA-ACTTCT-3（位于intron571～88）、NQO1 R:5'-GCGTTTCTTCCATCCTTC-3(位于extron 6104～87)PCR扩增是用Pekin-Elemer 9600PCR仪，反应总体积30μl,含有200μmol/L dNTP、两种引物各0.2μmol/L、5％的DMSO、0.4μgDNA、2单位TaqDNA聚合酶、10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)、1.5mmol/L MgCl2、50mmol/LKCl、0.1％Triton X-100。扩增长度为195bp。先在95℃下预变性2min，再以下列温度和时间循环35次：94℃30s；55℃30s；72℃45s；最后在72℃下延伸5min。将扩增产物10μl用20单位HinfⅠ限制性内切酶在37℃下消化2h，最后以8％的聚丙酰胺凝胶电泳及EB染色。若NQO1 C609→T碱基替换时，则产生一个HinfI酶切位点。扩增的片段被切成119bp和76bp两个片段。当基因型为野生型时（C/C），则不能被消化，为195bp;如基因型为杂合子（C/T）时则为195、119、76bp等三个片段；基因型为突变型（T/T）时，则为119、76bp两个片段^[10]。

　　1.3统计方法

　　组间基因型频率差异的检验采用χ²检验，用SPSS统计软件包完成。

　　2结果

　　2.1肺癌组与对照组NQO1等位基因频率比较

　　本研究发现在肺癌组中NQO1基因T等位基因的频率为53.7％，而对照组为43.0％，较对照组显著增高(χ²=5.107，P=0.024)。T等位基因携带者患肺癌的危险性是C等位基因的1.54倍(95％可信限:1.058～2.229)（见表1）。

　　2.2肺癌组与对照组NQO1基因型多态性分布比较

　　本研究发现NQO1各基因型频率在正常组分别为：野生型(C/C)为30.1％、杂合型(C/T)为53.7％、突变纯合子型(T/T)为16.2％,其基因型分布符合哈迪-温伯格平衡。在肺癌组分别为：野生型(C/C)为12.6％、杂合型(C/T)为66.3％、突变纯合子型(T/T)为21.1％。其分布频率在肺癌组和对照组相差显著（χ²=9.728，P=0.008）。T/C和T/T基因型携带者患肺癌的危险性分别是野生型纯合子（C/C）的2.949倍(95％可信限:1.426～6.096)与3.106倍(95％可信限:1.284～9.514)(见表2)。

　　3讨论

　　依赖还原型辅酶I(II)醌氧化还原酶(NQO1)是一种黄素酶。其基因定位在第16号染色体上，由6个外显子间以5个内含子组成，在人体的各个组织中均有表达^[2]。醌是一种有毒的化合物，它在自然界中广泛存在，如汽车废气、烟草的烟雾等，甚至存在于人们的许多食物中，与肿瘤的发生有密切的关系。由于NQO1催化醌还原为亲电子的水溶性醌，避免了亲核性的醌损伤DNA。许多研究发现NQO1对醌及其衍生物所致的突变、癌变和其它毒性有保护作用^[5～7]，因此对该酶的研究日益重视。

　　国外报道在正常人群中有4％～10％的人缺乏NQO1的活性，11％的人该酶的活性为中等水平^[8,9]，最初其原因并不清楚。Traver等人在BE细胞株（NQO1活性很低的肾上腺细胞瘤株）中，应用反转录PCR技术扩增出NQO1的cDNA序列，经测序发现其609位点发生了C→T的错义突变^[10]，该突变导致NQO1基因编码的187位氨基酸由脯氨酸变成了色氨酸，虽不影响其mRNA的合成，但可能改变了酶的二级结构，使酶的活性降低。进一步的研究发现该突变并非癌细胞所特有，在正常人群中均有该突变位点等位基因的纯合子和杂合子存在^[11]。说明NQO1基因在该位点具有多态性。

表2　NQO1基因型与肺癌的关系

　　我们对95例肺癌患者和136名健康对照组的研究表明，肺癌组突变型基因频率显著高于对照组，携带T等位基因可使个体患肺癌的危险性增加1.54倍。肺癌组带有T等位基因的基因型亦显著高于对照组，其突变杂合子基因型（T/C）可使个体患肺癌的危险性增加2.949倍,其突变纯合子基因型(T/T)可使个体患肺癌的危险性增加3.106倍。目前的研究发现在肝、肺、直肠癌及乳腺癌组织中，NQO1的基因表达增加，提示该酶在肿瘤的发展和肿瘤初发时细胞的防御机理中有重要作用^[12]。该结果表明NQO1基因的多态性与肺癌的发病有一定的关系。其原因可能是NQO1基因609位点发生的C→T的错义突变造成的NQO1酶活性的降低或缺乏，减弱了NQO1在对抗醌及其衍生物毒性的保护作用，使机体倾向于罹患恶性疾病，但这种倾向性的结果可能要和某一特定性的毒物结合方能发病。例如，吸烟这一肺癌的危险因素如果和NQO1基因的T等位基因共存，是否可使患肺癌的危险性增加，则是一个非常有意义的研究。已有研究表明，吸烟可使正常肺组织中NQO1基因的表达增加^[13],这可能是机体的保护性反应。反之，如果机体的NQO1的基因型是带有T等位基因，尤其是突变纯合子的基因型T/T，则吸烟可能不能使肺部的NQO1基因表达增加或增加较少，肺部NQO1的活性低下或缺乏，导致肺癌的发生。

　　另外，本研究发现在中国人NQO1基因型正常人群中有16.2％、肺癌患者中有21.1％为T/T突变纯合子，其体内的NQO1酶应为无活性的。对这类个体在应避免用含醌的抗肿瘤药物。因为这类药物需要经NQO1催化还原为水溶性的醌，再经自动氧化生成活性氧或经重排生成有活性的烷基化物，即所谓“生物还原活化作用”，从而起到抗肿瘤作用。因此，在临床上应用PCR-RFLP技术检测肿瘤病人的NQO1的基因型对指导抗肿瘤药物的应用有着重要的意义。

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收稿日期：1999－07－01;修回日期：1999－08－04