CK19 RT-PCR法检测淋巴结中肺癌微小转移灶

中国肺癌杂志 2000年第1期第3卷 肺癌分子生物学研究

作者：葛明建　王梅　李良彬　张玉洪　黄天禄

单位：葛明建　李良彬(重庆医科大学附属第一医院胸外科　400016)；王梅　张玉洪　黄天禄(检验科)

关键词：肺肿瘤；淋巴结；转移；角蛋白；聚合酶链反应

　　【摘要】目的　探索检测淋巴结中肺癌微小转移灶的新途径。方法　区域性淋巴结共159枚，取自20例可手术的原发性肺癌患者，将每枚淋巴结均分为两等份，分别进行癌转移的病理学检测和细胞骨架角蛋白19(CK19)基因的表达分析。结果　本实验建立的CK19 RT-PCR法可检测到1×10⁷个正常淋巴细胞中存在的10个肺癌细胞。在被测的159枚淋巴结中，42枚被病理切片和分子学方法同时证实存在转移，在余下的117枚病检阴性淋巴结中，CK19 RT-PCR还发现25枚存在微小转移。结论　与传统病理学检查相比，CK19 RT-PCR法可提高淋巴结癌转移检出率，从而准确地评价其转移状况。

Detection of lung cancer micrometastasis in regional lymph nodes by assays of CK19 reverse transcription-polymerase chain reaction

GE Mingjian,WANG Mei,LI Liangbin,ZHANG Yuhong,HUANG Tianlu

　　(Department of Thoracic Surgery,The First University Hospital,Chongqing University of Medical Science,Chongqing 400016,P.R.China)

　　【Abstract】Objective　To set up a molecular method(RT-PCR) which can be used to detect micrometastasis of regional lymph nodes(LNs) in patients with lung cancer.Methods　Primary lung cancer tissues (n＝20) and regional LNs (n＝159) were obtained from 20 patients with lung cancer who underwent lobectomy.Each LN was halved.One half of a LN was subjected to histological examination (HE) and the other half was subjected to RT-PCR amplification of CK19 mRNA.Serial dilution study using LC-5 cells was performed to detect sensitivity of the CK19 RT-PCR method.Results　Serial dilution study for LC-5 cells demonstrated that CK19 mRNA was detectable at a concentration as low as 10 LC-5 cells in 1×10⁷ LN cells.CK19 mRNA was found in 42 LNs that were proved to have metastasis by HE.Of the other 117 LNs which were diagnosed as no metastasis by HE,however,twenty five LNs were found to express CK19 mRNA by RT-PCR.Conclusion　Comparing with HE method,the RT-PCR method can make more accurate assessment of metastatic status in LNs.

　　【Key words】Lung neoplasms　　Lymph node　　Metastasis　　Keratin　　Polymerase chain reaction

　　准确评价肿瘤患者的淋巴结转移状况具有重要的临床意义，而传统病理学方法常低估淋巴结转移的存在，使其可靠性受到影响^［1］。本实验旨在建立和评价能准确检测肺癌患者区域性淋巴结中隐匿性微小转移灶(micrometastases)的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　组织标本　原发性肺癌组织(n＝20)及相应区域淋巴结(n＝159)取自本院1996年10月至1997年3月手术的20例肺癌患者，术中将每例患者肺门(N₁)和纵隔(N₂)等处的各组区域性淋巴结全部清除，然后在严格防止污染的前提下将每枚淋巴结切分为两等份，一份作病理检查(HE)，另一份淋巴结及肺癌组织保存于液氮中直至提取RNA。表1示20例患者的主要临床病理参数。正常淋巴结(n＝10)取自经病理证实的可手术的肺部非恶性肿瘤患者。

　　1.1.2　细胞株　人肺鳞癌细胞LC-5由本校病理生理教研室提供，人肺腺癌细胞PAa由北京医科大学病理学教研室提供。

　　1.1.3　主要试剂　异硫氰酸胍、二乙基焦碳酸(DEPC)和2-硫基乙醇等购于Sigma公司；逆转录酶MMLV-RT由GIBCO BRL公司提供；脱氧核糖核酸酶RQ1(DNase RQ1)、Taq DNA聚合酶、dNTP和PCR Marker购于华美生物工程公司；水饱和酚、氯仿和异戊醇等均为国产分析纯。实验试剂用无菌双蒸水配制，用于RNA提取的试剂或器皿均用0.1％ DEPC处理。

　　1.1.4　引物　下列引物由北京赛百盛(美国)生物工程公司合成。

　　根据β-actin的基因序列^［2］设计以下引物：上游引物(467-491) 5′-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3′；下游引物(1589-1565) 5′-AGGGTACATGGTGGTGCCGC-CAGAC-3′。以上引物分别位于第2和第4外显子，可扩增589?bp的cDNA片段。本片段用作内对照标准。

　　根据CK19基因序列^［3］设计以下引物：上游引物(757-786) 5′-TCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACC-3′；下游引物(1502-1473) 5′-CGCGACTTGATGTCCATG-AGCCGCTGGTAC-3′。上、下游引物分别位于第1和第6外显子，可扩增745?bp的CK19 cDNA片段。

　　1.1.5　主要仪器　PCR扩增仪9600型(美国PE公司)和UV-240紫外分光光度仪(日本岛津株式会社)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　提取组织总RNA采用AGPC一步法^［4］。

　　1.2.2　DNase消化RNA标本　参照我们以前介绍的方法^［5］。

　　1.2.3　RT-PCR　将100?ng RNA加入以下逆转录体系中：01igo(dT)₁₈ 25?pmol／L，dNTP各500?μmol／L，Tris-HCl 50?mmol／L，KCl 50?mmol／L，MgCl₂ 10?mmol／L，MMLV-RT 200?U，总体积25?μl，37℃下孵育1?h。取2?μl逆转录产物加入以下混和物中：CK19或β-actin引物20?pmol／L，dNTP各200?μmol／L，Taq DNA酶1?U，Tris-HCl 10?mmol／L，KCl 50?mmol／L，MgCl₂ 1.5?mmol／L，总体积25?μl。CK19反应条件为94℃?45?s，72℃?150?s；β-actin反应条件为94℃?45?s，60℃?45?s，72℃?60?s。循环40次，最后72℃下充分延伸5?min结束反应。取5?μl产物在2％琼脂糖凝胶板上电泳，溴化乙锭染色。在紫外透射反射仪上观察结果并拍照。

　　1.2.4　灵敏度实验　将正常淋巴结组织100?ng与3?ml DEPC处理水混和后匀浆，用Ficoll-Hypaque分离液密度梯度离心，取淋巴细胞于镜下计数，将其调整为10⁷数量级的细胞悬液Ⅰ共10份。将肺鳞癌细胞LC-5连续稀释为以下各数量级的细胞悬液Ⅱ：10⁵，10⁴，10³，10²，10¹，1，1，1，1，1。将以上两种细胞悬液分别混和制成代表不同浓度的混和液，提取RNA，分别进行CK19和β-actin mRNA表达分析。

　　1.3　统计学处理　采用χ²检验，以P＜0.05为差异显著性。

　　2　结果

　　2.1　CK19 mRNA在原发性肺癌组织、正常淋巴结及LC-5、PAa细胞中的表达(图1)　CK19 mRNA在所有原发性肺癌组织中都有表达，在肺癌细胞LC-5及PAa中也有表达，而在正常淋巴结中均无表达。

图1　CK19 mRNA在原发性肺癌组织、正常淋巴结、LC-5和PAa细胞中的表达

　　1：分子量标准；2、3：原发性肺癌组织；4、5：正常淋巴结；6：肺鳞癌细胞LC-5；7：肺腺癌细胞PAa；8：空白对照

　　Fig 1　CK19 mRNA expression in primary lung cancer tissue,normal control LNs and LC-5,PAa cells.Lane 1: molecular marker; Lane 2,3: lung cancer tissues; Lane 4,5: normal lymph nodes; Lane 6,7:LC-5 and PAa cells; Lane 8: control.

　　2.2　CK19 RT-PCR法的检测灵敏度　灵敏度实验发现，在10个LC-5细胞／10⁷个正常淋巴细胞浓度时，CK19 mRNA仍可被检测到。为了考查1个LC-5细胞／10⁷个正常淋巴细胞浓度时的检测灵敏度，本实验准备了4份此浓度的混和物，结果这4份混和物中的CK19 mRNA均未被扩增出(图2)。

图2　CK19 RT-PCR法的灵敏度

　　Fig 2　Sensitivity of the CK19 RT-PCR method

　　Detection of sensitivity was determined by performing serial dilution of LC-5 cells and preparing mixture with normal LN cells.Total RNA was extracted from these mixtures.CK19 mRNA expression were studied on these RNA sample by RT-PCR.Result of agarose gel electrophoreses are shown.

　　2.3　RT-PCR法和常规病理方法检测淋巴结肺癌转移结果比较　RT-PCR法和病检法同时检测159枚区域性淋巴结肺癌转移的结果见表1。两法同时检测淋巴结中肺癌转移的结果比较见表2(χ²＝25.00，P＜0.005)。图3示RT-PCR法检测第20例患者淋巴结中肺癌微转移结果。

表1　20例肺癌患者的临床病理资料及区域性淋巴结中肺癌转移情况

　　Tab 1　Patient characteristics and the results of lung cancer metastasis in single lymph node

　　m:Male; F: Female; SCC:Squamous cell carcinoma; CS:Carcinosarcoma;SCLC:Small cell lung cancer; ADC:Adenocarcinoma; ASC:Adenosquamous carcinoma

表2　CK19 RT-PCR和常规病检法检测淋巴结肺癌转移结果比较

　　Tab 2　Comparison between HE and CK19 RT-PCR detection

　　of lung cancer metastases in regional lymph nodes

　　χ²＝25.00，P＜0.005

　　3　讨论

　　选择合适的“组织特异性标志物”(tissue specific marker)是成功运用RT-PCR法检测肿瘤微转移的首要条件。研究表明，上皮细胞骨架成分之一——角蛋白CK19的表达主要局限于上皮组织及相应来源的肿瘤组织，在正常外周血和淋巴结等组织中均无表达。若在上皮源性肿瘤患者的淋巴结等组织中检测到CK19基因表达则表明存在癌细胞转移^［6］。本研究将CK19作为检测标志物，结果发现CK19基因具有上皮组织表达特异性，符合“上皮组织特异性标志物”的条件。目前，分析CK19基因表达已经广泛用于乳腺癌等实体瘤淋巴结中微小转移的检测^［7］。

图3　CK19 RT-PCR法检测淋巴结中肺癌微小转移(第20例患者)

　　1：分子量标准；2：原发性肺癌组织；3：正常淋巴结；4～9：被测淋巴结。病检结果示第5和第8淋巴结转移，CK19 RT-PCR法检测结果示除第5、8淋巴结外，第6淋巴结还存在肺癌微转移。

　　Fig 3　Detection of lung cancer micrometastases in LNs by CK19 RT-PCR methods (Case 20).The number of involved lymph nodes was two by the histological diagnosis (Lane 5 and Lane 8) and three by the genetic diagnosis (Lane 5,6 and 8).RT-PCR amplification of CK19 mRNA for primary lung cancer tissue (Lane 2) and normal control LN (Lane 3) were used as positive and negative control respectively.

　　防止假阳性出现是RT-PCR法检测肿瘤微转移成功的关键。假基因(pseudogene)的干扰是造成RT-PCR法诊断癌转移时出现假阳性结果的主要原因之一。我们发现设立RT阴性对照(－RT)可及时发现假基因的干扰，而在cDNA合成以前用DNase预处理RNA标本可有效地消除假基因的干扰^［5］。造成假阳性的另一个重要原因是标本受到污染，这其中包括来自正常上皮细胞和癌细胞的污染，以及淋巴结之间的交叉污染。此外，前次PCR产物的污染也可造成假阳性结果。我们通过设立空白对照、阳性和阴性对照，以及严格遵守实验操作规则来克服污染产生的假阳性结果^［8，9］。

　　目前，病理检查结果仍然是临床医师判断肿瘤淋巴结转移情况和制定各项术后辅助性治疗措施的主要依据。然而，传统的病理学方法只是通过对单张淋巴结病理切片(约相当于整个淋巴结体积的1％)的转移情况的分析来评判整个淋巴结的癌转移情况，难免具有片面性，常低估淋巴结转移的存在^［1］。连续切片法(SMS)虽可提高淋巴结转移检出率，但因费时费力而使其运用于临床的可能性不大^［7］。我们运用CK19 RT-PCR法对159枚区域性淋巴结中肺癌转移状况进行了检测，并且与病理检查进行比较，结果表明本法可提高淋巴结转移检出率，这对于提高肿瘤分期准确率、早期预测肿瘤术后复发和准确判断患者预后等均有指导意义，对筛选存在亚临床转移的患者以及加强对这部分人的术后辅助性全身治疗，以降低术后复发率、提高生存率均有重要意义。

　　将RT-PCR方法运用于恶性肿瘤淋巴结、外周血和骨髓等处微小转移灶的测定近几年才在国外开展起来，近年来国内同行也进行了这方面的探索，将此分子学方法运用于肝癌、乳腺癌等实体瘤微转移的研究中，初步显示了其实用价值和临床意义^{［10，11］}。本研究以CK19基因作为检测标志物，扩增了它在肺癌患者区域性淋巴结中的表达，得出了与以上研究相一致的初步结论。在采集标本时我们尽量清扫肉眼可见到的各组淋巴结，以便进行长期而大量的随访以积累足够的资料，从而准确评估本法检测肿瘤微转移的临床意义。

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收稿日期：1999-05-21

修回日期：1999-12-28