肺癌放射免疫导向手术的动物实验研究
中国肺癌杂志 2000年第1期第3卷 实验研究
作者：王钰琦 孙玉鹗 高霭峰
单位：王钰琦 孙玉鹗(解放军总医院胸外科 北京，100853)；高霭峰(沈阳铁路总医院病理科)
关键词：放射免疫导向手术；生物素－亲和素系统；肺肿瘤；荷瘤小鼠
【摘要】目的 探讨放射免疫导向手术在检测小鼠肺腺癌动物模型肿瘤转移的灵敏度、特异性及可靠性。方法 应用抗人肺腺癌单克隆抗体LC-1生物素化预定位技术，进行肺腺癌小鼠放射免疫导向手术。结果 γ照相机体外显像和井型探测仪体内放射性分布探测的结果显示：在注射放射性核素2?h后，生物素化抗体预定位的荷瘤小鼠的肿瘤即有明显放射性浓集，其原发肿瘤和肺部转移灶的T／NT比值均显著高于未进行生物素化抗体预定位的荷瘤小鼠(P＜0.01)。应用手持型γ探测仪(GDP)对荷瘤小鼠进行体内探测，判别小鼠肺部肿瘤转移的灵敏度为96％，特异性为98％，准确率为97％。结论 采用抗肺腺癌单克隆抗体LC-1生物素化预定位技术能明显提高小鼠肿瘤的放射性浓集，应用GDP进行小鼠体内探测可以探测出肿瘤及肺部微小转移灶。
The experimental study of radioimmunoguided surgery for lung cancer
WANG Yuqi,SUN Yu'e,GAO Aifeng
(Department of Thoracic Surgery,General Hospital of PLA,Beijing 100853,P.R.China)
【Abstract】Objective To determine the sensitivity,specificity and reliability of radioimmunoguided surgery in detecting the tumor micrometastases of the mice models bearing pulmonary adenocarcinoma.Methods Radioimmunoguided surgery was performed on mice models bearing pulmonary adenocarcinoma with antihuman lung adenocarcinoma monoclonal antibody (LC-1) by biotin-avidin pretargeting technique.Results The result of γ-camera radioimmunoimaging and the data of radioactivity biodistribution provided by standard gamma well counts showed: as early as 2 hours after injection,radioactivity had accumulated in tumors of the biotinylated monoclonal antibodies pretargeting mice.The T／NT ratios of the primary tumors and the metastases in the lung were significantly higher in the biotinylated monoclonal antibodies pretargeting mice than those without undergoing such treatment(P＜0.01).Based on the application of GDP to identify the metastases in the lung,the sensitivity,specificity and accuracy of RIGS were 96％,98％ and 97％ respectively.Conclusion Biotin-avidin pretargeting techniques could remarkably enhance the radioactive deposition on tumors of the biotinylated LC-1 pretargeting mice.The primary tumors and the micrometastases in the lung could be detected in vivo by GDP.
【Key words】Radioimmunoguided surgery,RIGS Biotin-avidin system,BAS Lung neoplasms Tumor-bearing mice
有效及敏感地检测肿瘤侵及范围和转移对肿瘤准确分期和制定合理治疗方案非常重要。80年代中期开展起来的放射免疫导向手术(radioimmunoguided surgery,RIGS)已经被证实在指导术者制定合理的手术方案、提高TNM分期的准确性等方面具有极大的优势［1～6］。RIGS基本方法是：术前将放射性核素标记的肿瘤抗体注入体内，使肿瘤部位有放射性物质沉积，术中用手持型γ探测仪(hand-held gamma-detecting probe,GDP)进行放射性探测来确定肿瘤部位。RIGS可以辅助外科医生在术中判断肿瘤的侵及范围，帮助术者决定手术切除范围和手术方案，使手术更加合理化和个体化。该技术在结直肠癌和转移性肝癌等方面的应用已取得了较好的临床效果［7，8］。但RIGS在胸部肿瘤手术中应用较少，主要是由于胸腔内大血管和心脏等的放射性本底高，影响GDP术中探测肿瘤［9～11］。
本动物实验研究应用生物素－亲和素系统(biotin-avidin system，BAS)进行RIGS动物实验，首先向动物体内注入生物素化的抗肺癌单克隆抗体，然后注入亲和素，第三步再注入生物素化的放射性核素。注射放射性核素2?h后进行RIGS动物实验。我们想以此研究为RIGS在胸外科的广泛应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物模型建立 取正常传代培养的LA-795瘤株细胞(中国医学科学院肿瘤研究所提供)，用生理盐水按常规制成单细胞悬液，于T739小鼠右后臀部皮下接种。
1.2 抗人肺腺癌单克隆抗体LC-1的生物素化［12］ 将N-羟基琥珀酰亚胺酯活化生物素(N-Hydroxysuccinimidobiotin,Sigma Chemical Co.USA)二甲基亚酰胺(DMF)溶液滴加至抗人肺腺癌单克隆抗体LC-1(中国科学院上海细胞生物学研究所)NaHCO3溶液中(200?mmol／L pH?8.5)，4℃搅拌过液。上述混合液体以4℃生理盐水透析8?h。分装后低温保存。
1.3 放射核素99mTc标记DTPA-B 将氯化亚锡盐酸溶液滴加入DTPA-Biotin (Sigma Chemical Co.USA) PBS溶液中，边震荡边加入99mTcO4液，室温下反应后经Sephadex G-100层析分离。纸层析法测定标记率，展开剂为85％甲醇。
1.4 动物实验
1.4.1 动物分组 分四组：实验组、肿瘤对照组、抗体对照组和DTPA对照组。每组10只小鼠。实验组、抗体对照组和DTPA对照组的小鼠为接种肿瘤15天以上的荷瘤小鼠，肿瘤对照组的小鼠为接种肿瘤7天之内的荷瘤小鼠。
1.4.2 实验方法 实验组和肿瘤对照组经尾静脉注射50?μg／100?μl生物素化抗体(Biotin-LC-1)，抗体对照组注射2?μg／100?μl生物素(biotin)，DTPA对照组注射100?μl生理盐水；2?d以后，实验组、肿瘤对照组和抗体对照组注射50?μg／100?μl亲和素(avidin)，DTPA对照组注射100?μl生理盐水；再过2?d，各组均注射3.7×106?Bq／2?μg放射核素99mTc标记生物素(99mTc-DTPA-B)。
注射99mTc-DTPA-B 2?h之后，固定动物并置于γ照相机(日本TOSHIBA 501S数字照像机)下进行动物显像。显像后对小鼠实施手术：打开胸腔和腹腔暴露各脏器，然后用GDP依次对肿瘤及各脏器进行探测(每次计数20?s，共3次)。探测完毕后，行心脏穿刺放血，拉颈处死。分离各脏器和肿瘤组织，行井型探测仪放射性测量，计算各脏器和组织的放射性分布(％ injected dose／gram，％ID／g)和肿瘤／非肿瘤放射性比值(T／NT)。各组织标本送病理检查。
1.5 统计学处理 采用t检验。
2 结果
2.1 LA-795小鼠肺腺癌转移模型特点 小鼠皮下接种LA-795瘤细胞成功率为100％，无自然消退。皮下移植瘤的平均潜伏期为7.5?d，7?d之内100％无肺部肿瘤转移，12?d以上100％有肺部肿瘤转移。经病理学检查，本研究中实验组、抗体对照组和DTPA对照组的小鼠肺部均有肿瘤转移，肿瘤对照组的小鼠肺部均无肿瘤转移。
2.2 动物显像结果 各组肾脏都有较高的放射性浓集。实验组和肿瘤对照组的小鼠在注射放射性核素2?h后，肿瘤有放射性浓集，显像时肿瘤呈显著的热区。抗体对照组和DTPA对照组则未见肿瘤的放射性浓集。
2.3 井型探测仪探测体内放射性分布的结果 各组肾脏都存在高摄取，这一点与体外显像结果一致。在应用了生物素－亲和素预定位技术的实验组、肿瘤对照组和抗体对照组中，非肿瘤组织的放射性分布明显低于没有应用该技术的DTPA对照组(P＜0.01)。应用生物素化抗体预定位的实验组的肿瘤放射性摄取在2?h达到1.35％ID／g，显著高于没有应用该技术的抗体对照组(P＜0.01)。实验组有肿瘤转移的肺组织的放射性分布平均为(0.66±0.12)％ID／g，肿瘤对照组正常肺组织为(0.26±0.09)％ID／g，二者相差2.5倍。注射放射性核素2?h后，实验组血、肺和肌肉的T／NT分别为5.87、2.04和8.43；抗体对照组则分别为1.35、1.12和3.38，两组比较均有非常显著差异(P均＜0.01)(图1)。
2.4 GDP术中探测结果 注射放射性核素标记物2?h后，采用GDP对各器官进行探测(图2)。实验组和肿瘤对照组中肿瘤的T／NT均较抗体对照组和DTPA对照组高(P均＜0.01)。实验组血、肺和肌肉T／NT分别为5.25、3.24和10.05，抗体对照组则分别为1.32、1.51和3.75，二组比较差异均非常显著(P均＜0.01)。
GDP测得实验组有肿瘤转移的肺组织的放射计数平均为712±80.2(582～872)，肿瘤对照组肺组织放射计数平均为240±37.9(183～303)。我们以实验组有肿瘤转移的肺组织为T，以肿瘤对照组肺组织为NT，二者计数比(T／NT)最大值为4.77，最小值为1.92，平均2.97±0.86。经过统计学分析及与病理结果比较，以二者比值2为界限来确定是否有肿瘤转移，即GDP进行术中探测时，某肺组织放射计数高于正常肺组织2倍以上，即可判定为该肺组织中有肿瘤转移。比较GDP探测结果与病理检查结果：50个RIGS探测阳性的肺组织标本，病理证实的为49个；50个RIGS判定为阴性的标本，病理证实的为48个。应用RIGS判别肺组织肿瘤转移的灵敏度为96％(49／51)，特异性为98％(48／49)，准确率为97％(97／100)。术中探测发现的最小的肺转移瘤直径为1?mm，某些肺组织内可见有微小的局灶性癌巢。
图 1 井型探测仪探测各组T／NT结果
Fig 1 Detection of T／NT by standard gamma well counts
图 2 GDP探测各组T／NT结果
Fig 2 Detection of T／NT by GDP
3 讨论
RIGS的实验及临床研究始于80年代中期，多以下腹部肿瘤如结肠癌、卵巢癌等为主，胸部肿瘤研究的报道较少，究其原因有两个方面［9～11］：①难以获得对胸部肿瘤亲和力较高的、特异性强的单克隆抗体；②胸腔内有心、肺等血流丰富的高本底器官，故肿瘤很难获得较高的T／NT比值。生物素－亲和素预定位技术应用于RIGS的成功以及高特异性的肺癌单克隆抗体LC-1的出现，为我们研究胸部肿瘤RIGS提供了可能。
通过实验我们初步证明，应用生物素－亲和素三步标记法于肺腺癌转移瘤动物模型时，肺腺癌单克隆抗体LC-1可以有效地沉积于肿瘤组织中，应用手持型γ探测仪进行术中探测获得了较高的T／NT比值。术前完成注射生物素化抗体和亲和素的准备，手术当天注射放射性核素99mTc标记的生物素，2?h后即可行RIGS。实验结果显示肿瘤有较高的T／NT，其中与肌肉比值(T／NT)最高，为10.05±2.57。同样，有肿瘤转移的肺组织与正常肺组织比较也有较高的T／NT比值。经过统计分析及与病理结果比较，我们定下判定肺部是否有肿瘤转移的T／NT界限为2。我们以该标准进行RIGS，灵敏度为96％，特异性为98％，准确率为97％，成功地探测出了实验组内肺部微小的转移瘤(直径为1～2?mm)。
本研究是国内首次把BAS与RIGS结合在一起，成功地进行肺癌单克隆抗体LC-1的放射免疫导向手术的动物实验。在注射放射性核素2?h后即可进行术中探测，缩短了放射性核素注入体内后等待手术的时间。该方法能在短时间内使肿瘤获得最大T／NT比值。应用GDP不但可以准确地探测出荷瘤小鼠的原发肿瘤，而且在探测肺部微小肿瘤转移灶方面也取得了满意的效果，为今后临床上应用肺癌单克隆抗体进行术中免疫导向手术打下了基础。
从我们的实验结果中可见，虽然肿瘤可以获得较高的T／NT，但肾脏仍然有较高的放射性摄取，这对进行术中探测有一定的影响，是今后需要改进的方面。
参考文献
1，Arnold MW,Schneebaum S.Berens A,et al.Radioimmunoguided surgery challenges traditional decision-making in patients with primary colorectal cancer.Curr Surg,1992,112(5)∶624.
2，Arnold MW,Yong DC,Hitchcock CL,et al.Radioimmunoguided surgery in primary colorectal carcinoma: an intraoperative prognostic tool and adjuvant to traditional staging.Am J Surg,1995,170(4)∶315-318.
3，Cohen AM,Martin EW,Lavery I,et al.Radioimmunoguided surgery using iodine-125-B72.3 in patients with colorectal cancer.Arch Surg,1991,126(3)∶349-352.
4，Martin DT,Hinkle GH,Tuttle S,et al.Intraoperative radioimmunodetection of colorectal tumor with a hand-held radiation detector.Am J Surg,1985,150(6)∶672-675.
5，Yokota T,Milenic DE,Whitlow M,et al.Microautorsdiographic analysis of the normal organ distribution of radioiodinated single-chain FV and other immunoglobulin forms.Cancer Res,1993,53(16)∶3776.
6，Yokota T,Milenic DE,Whitlow Marc,et al.Rapid tumor penetration of a single chain FV and comparison with other immunoglobulin forms.Cancer Res,1992,52(12)∶3402-3408.
7，Martin EW Jr,Mojzisik CM,Hinkle GH,et al.Radioimmunoguided surgery using monoclonal antibody.Am J Surg,1988,156(5)∶386-392.
8，Sickle-Santanello BJ,O'Dwyer PJ,Mojizisik CM,et al.Radioimmunoguided surgery using the monoclonal antibody B72.3 in colorectal tumors.Dis Colon Rectum,1987,30(7)∶761-764.
9，Grazia M,Bini A,Stella F,et al.Radioimmunoguided surgery and intraoperative lung cancer staging.Semin Surg Oncol,1998,15(2)∶215-219.
10，Parti U,Robeda L,Scoppetta N,et al.Radioimmunoguided surgery for lung metastases from colorectal cancer: results and perspectives.Semin Surg Oncol,1998,15(2)∶223-225.
11，Pastore V,Di Lieto E,Mansi L,et al.Intraoperative detection of lung cancer by octreotide labeled to indium-111.Semin Surg Oncol,1998,15(2)∶220-222.
12，Stella M,DeNardi P,Paganelli G,et al.Avidin-biotin system in radioimmunoguided surgery for colorectal cancer: advantages and limits.Dis Colon Rectum,1994,37(4)∶335-343.
(收稿日期：1999-11-01)
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