肺癌组织和支气管切缘p53基因突变研究
中国肺癌杂志 2000年第1期第3卷 肺癌分子生物学研究
作者：许林 程梅 俞明锋 黄建峰 薛开先 王毓三
单位：许林 俞明峰 黄建峰(江苏省肿瘤医院胸外科 南京，210009)；程梅 王毓三(江苏省临床检验中心)；薛开先(细胞遗传室)
关键词：肺肿瘤；切缘；p53基因
【摘要】目的 检测肺癌组织和支气管切缘p53基因突变，以预测肺癌手术切除的效果和局部复发。方法 用PCR-SSCP方法，检测50例肺癌和7例肺部良性疾病手术切除标本的支气管切缘(切缘病理无癌残留)、病灶组织和正常肺组织中的p53基因突变，并随访了解术后切缘癌复发与癌复发转移情况。结果 14例(28％)肺癌支气管切缘和28例(56％)肺癌组织存在p53基因突变，正常肺组织和良性病变肺组织未发现p53基因突变。肺癌组织p53基因突变以小细胞癌(100％)最高，次为鳞癌(65％)，腺鳞癌(60％)，腺癌(38.9％)。p53基因突变以TNM分期的Ⅲ期(72.7％)最高，次为Ⅱ期(58.3％)，Ⅰ期(25％)。支气管切缘p53阳性者术后随访3～16月，6例(42.9％)发生支气管残端癌复发；而p53阴性者术后无残端癌复发。肺癌组织p53阳性者中有17例(60.7％)在随访中发现癌复发转移；p53阴性者中5例(22.7％)发现癌复发转移，两组复发率有显著差异(P＜0.05)。结论 检测支气管切缘p53基因突变能确诊支气管切缘异常的“分子边界”，从而早期预测部分肺癌的术后残端癌复发。肺癌组织p53基因突变者术后癌复发转移率高。
Detection of mutant p53 gene at resection margin of the bronchus and cancer tissues to predict lung cancer recurrence
XU Lin,CHEN Mei,YU Mingfeng,HUANG Jianfeng,XUE Kaixian,WANG Yusan
(Department of Thoracic Surgery,Jiangsu Cancer Institute and Hospital,Nanjing 210009,P.R.China)
【Abstract】Objective To investigate the mutations of p53 gene at the resection margins of the bronchus and cancer tissues,and to predict lung cancer recurrence.Methods PCR-SSCP technique was used to detect mutation of p53 gene at the resection margin of the bronchus (no cancer cells remained by gross pathological examination),cancer tissue and normal tissue of the lungs in 50 patients with lung cancers and 7 patients with non-cancerous pulmonary diseases.Local recurrence at the resection margin of bronchus and distant metastasis were investigated.Resutls Of the 50 patients,14 cases(28％) had p53 gene mutation at the resection margin of bronchus,and 28 cases (56％) had p53 gene mutations in their cancer tissue.The mutations were not found in normal tissues of the 50 patients and in tissues of the 7 control patients.The mutation rate of p53 gene in cancer tissue was 100％(2／2) for small cell lung cancer,65％(13／20) for squamous-cell carcinoma,60％(6／10) for adenosquamous cell carcinoma,38.9％(7／18) for adenocarcinoma.Mutation rate of p53 gene was 72.7％(16／22) in stage Ⅲ lung cancer,58.3％(7／12) in stage Ⅱ,25％(4／16) in stage Ⅰ.During follow-up (ranged from 3 months to 16 months),6 of 14 patients (42.9％) with mutant p53 gene at the resection margin had local recurrence.There was no recurrence in patients without mutant p53 gene at the resection margin.Seventeen of 28 patients (60.7％) with mutant p53 gene in cancer tissue had recurrence or metastasis,but only 5 of 22 patients (22.7％) without mutant p53 gene had local recurrence (P＜0.05).Conclusion By testing mutations of p53 gene at the resection margins of bronchus,we may predict local recurrence of lung cancer.Patients with mutant p53 gene in cancer tissue appear to have a substantially increased risk of recurrence and metastasis of lung cancer.
【Key words】Lung neoplasms Resection margin p53 gene
肿瘤抑制基因p53的突变是人类恶性肿瘤最常见的遗传学改变［1，2］。p53突变也常见于各类肺癌，80％～100％的小细胞肺癌(SCLC)和50％～70％的非小细胞肺癌(NSCLC)中有p53突变［2～5］。我们通过检测肺癌组织和支气管切缘p53基因突变，确定其异常的“分子边界”，以预测肺癌手术切除的效果和局部复发情况。
1 材料与方法
1.1 临床资料 自1998年2月至1999年3月间对57例肺部手术切除标本进行p53基因突变检测。57例病例中男性43例，女性14例，年龄30～77岁，平均年龄54.5岁。肺癌50例，肺部良性疾病7例；鳞癌20例，腺癌18例，腺鳞癌10例，小细胞癌2例，肺结核球3例，炎性假瘤3例，硬化性血管瘤1例。按UICC 1997肺癌分期标准分期：ⅠA期3例，ⅠB期13例，ⅡA期8例，ⅡB期4例，ⅢA期16例，ⅢB期6例。
1.2 标本 取肺癌患者手术切除的肿瘤组织和支气管切缘组织(病理检测切缘无癌细胞残留)，同时取相应的正常肺组织(距离癌组织5?cm以上)，取肺部良性疾病病变组织。所有标本均保存于－70℃冰箱中。
1.3 试剂 根据文献设计4对寡核苷酸引物，引物由中国科学院上海细胞所合成，引物序列见表1，分别扩增p53基因外显子5～8。Taq酶为Promega公司产品，dntp为华美生物工程公司产品。
表1 引物序列
Tab 1 Primer sequence
| Primer |
Primer sequence(5′3′) |
Size of amplification
product (bp) |
| P5A
P5B |
TACTCCCCTGCCCTCAACA
CATCGCTATCTGAGCAGCGC |
183 |
| P6A
P6B |
GTCTGGCCCCTCCTCAGCAT
CTCAGGCGGCTCATAGGGCA |
113 |
| P7A
P7B |
GTTGGCTCTGACTGTACCAC
CTGGAGTCTTCCAGTGTGAT |
110 |
| P8A
P8B |
TGGTAATCTACTGGGACGG
CTCGCTTAGTGCTCCCTGG |
137 |
1.4 方法
1.4.1 提取组织DNA 用常规酚氯仿法提取组织DNA。
1.4.2 PCR扩增和PCR-SSCP分析 PCR反应总体积为50?μl，其中含DNA约0.1?μl(合组织提取液10?μl)，4对引物各0.2?μmol／L，4种dntp各250?μmol／L，Taq酶1?U，97℃预变性7?min，然后94℃ 55?s60℃ 40?s70℃ 40?s，循环30次。取PCR产物10?μl，加入等体积的SSCP变性液(95％甲酰胺，20?mmol／L EDTA)。沸水浴5?min，冰上骤冷，立即上样于8％中性聚丙烯酰胺凝胶，在0.5 TBE中100?V电泳6?h，凝脉经EB染色并在紫外灯下观察，根据切缘样品PCR产物单链带泳动位置与正常对照的差异来判断样品中是否有突变。
1.5 临床研究 所有患者于术后第3～6月做纤维支气管镜和胸部CT检查，了解支气管残端和胸内有无癌复发及转移。观察癌复发及转移情况与p53基因突变之间的关系。
2 结果
2.1 p53基因突变和复发的关系 随访所有患者，随访期为3～16月。50例肺癌患者中14例支气管切缘为p53阳性，阳性率为28％，随访期内有6例切缘癌复发，其中2例ⅢA期腺鳞癌，1例ⅢB期腺鳞癌，1例ⅢA期小细胞癌，1例ⅢB期鳞癌，1例ⅡA期腺癌；36例切缘p53阴性者无癌复发。在50例肺癌患者的癌组织中，28例为p53阳性，随访期内17例癌复发，复发率为60.7％，其中6例为支气管残端癌复发，11例为癌转移复发，ⅠB期1例(鳞癌)，ⅡA期2例(腺癌、腺鳞癌各1例)，ⅡB期2例(腺鳞癌、小细胞癌各1例)，ⅢA期8例(腺癌3例，鳞癌、腺鳞癌各2例，小细胞癌1例)，ⅢB期4例(腺癌2例，鳞癌、腺鳞癌各1例)，转移复发的部位主要为同侧或对侧纵隔淋巴结转移、锁骨上淋巴结转移或／和恶性胸腔积液；22例p53阴性者中5例癌复发，复发率为22.7％，其中ⅡB期1例，ⅢA期2例，ⅢB期2例。癌组织p53阳性的癌复发率与癌组织p53阴性的相比较有显著性差异(P＜0.05)。而在癌旁正常肺组织和7例肺部良性疾病的病灶及支气管切缘组织中均未发现有p53基因突变。14例支气管切缘p53基因突变者的癌组织p53均为阳性。
2.2 p53基因突变与病理类型、TNM分期的关系 50例肺癌患者中鳞癌的p53基因突变率在支气管切缘和癌组织中各为20％(4／20)和65％(13／20)，腺癌为16.7％(3／18)和38.9％(7／18)，腺鳞癌均为60％(6／10)，小细胞癌为50％(1／2)和100％(2／2)。随病情的进展，肺癌患者的p53基因突变表达亦显著增加。Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期肺癌支气管切缘p53基因突变率分别为12.5％(2／16)，25％(3／12)，40.9％(10／22)；癌组织分别为25％(4／16)，58.3％(7／12)，72.7％(16／22)。
3 讨论
目前，人们已发现在肿瘤发病过程中有多种癌基因和抑癌基因的改变，其中突变的p53基因起了十分重要的作用。近年来的研究表明p53抑癌基因是“分子警察”，是细胞生长的“监控器”。当细胞受到外源性理化因素影响，DNA受损伤时，它能使细胞分裂停止在G1／S期，让细胞修复损伤，恢复正常，如损伤不能修复，p53便促进细胞凋亡，这样使有癌变倾向的细胞自我消亡。但在多种致癌因子如吸烟等因素长期作用下，p53抑癌基因可发生结构和功能上的改变，致使p53基因突变，失去抑癌的功能，反而促进细胞癌变［1，2］。p53突变在肺癌中发生的频率很高，可达到60％～90％的突变率［2～5］，而myc，ras，erbB和Rb等癌基因和抑癌基因的突变或扩增、失活没有超过44％的［6］，但在正常肺组织中未发现p53突变［7］。我们应用高灵敏的分子生物学技术(PCR-SSCP法)，从分子水平检测了50例肺癌支气管切缘p53突变情况，发现28％的患者切缘p53突变，而常规病理组织学检查显示支气管切缘无癌细胞残留。此外，在检测到切缘p53突变的患者中有42.9％在术后3～10月中出现切缘癌复发，而未检测到切缘p53突变者无一例出现切缘癌复发，这提示p53突变可预测切缘癌复发，且分子学诊断早于临床诊断3～10月，与Brennan等［8］报道的相似，证实检测支气管切缘p53基因突变能确认支气管切缘异常的“分子边界”，对于预测肺癌手术切除的效果和局部复发有重大的意义，并能为处于“亚临床”即肿瘤负荷较小的癌基因突变的患者进行化学预防治疗提供分子学依据。
近来一些国内外学者认为肺癌组织p53突变与病理类型、病期及生存率有关［8～10］，本组结果显示小细胞肺癌组织p53突变率为100％，鳞癌为65％，腺癌为38.9％，腺鳞癌为60％，与大宗病例报道相似。而Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期的肺癌组织p53突变率分别为25％，58．3％，72.7％，p53突变率随期别增高而增加，与廖美琳等［9，10］报道的一致。28例肺癌组织p53阳性者中除6例为支气管残端癌复发外，另11例为术后转移复发，该类患者肿瘤复发率较癌组织p53阴性者有显著增高，提示肺癌组织p53阳性者术后癌转移复发的可能性大，生存率低。所以我们认为，对肺癌组织p53阳性者术后应该进行及早的、有计划的综合治疗，以提高这类患者的生存率。
本课题受江苏省社会发展科技计划项目基金(97043)资助
参考文献
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9，Kerr JFR,Winterford CM,Harmon BV,et al.Apoptosis：its significance in cancer therapy.Cancer,1994,73(8)∶2013-2026.
10，廖美琳，林振群，周允中，等.非小细胞肺癌生物学特性检测的临床意义.中华结核和呼吸杂志，1998，21(1)∶30-33.
收稿日期：1999-11-09
修回日期：2000-02-03
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