非小细胞肺癌多药耐药基因表达及环孢菌素A对其逆转作用
中国肺癌杂志 2000年第3期第3卷 论著
作者：张晓春 曲凤声 岳长青 杨秀云 洪士强 徐功立
单位：张晓春 曲凤声 杨秀云 洪士强 徐功立(250021 济南，山东省立医院肿瘤研究治疗中心)；岳长青（青岛第二卫校）
关键词：非小细胞肺癌；多药耐药基因；逆转录聚合酶链反应；环孢菌素A
【摘要】 目的 研究非小细胞肺癌（NSCLC）患者多药耐药基因(MDR1)表达与化疗疗效间的关系，观察环孢霉素(CsA)逆转MDR1的疗效及毒性。方法 利用RT-PCR技术检测46例NSCLC患者肿瘤细胞和外周血淋巴细胞MDR1表达，根据检测结果将患者分成MDR1阳性逆转组、MDR1阳性对照组和MDR1阴性组。所有患者接受至少2个周期的化疗，阳性逆转组患者在化疗同时给予CsA，剂量为4?mg／kg。结果 肿瘤细胞MDR1阳性率为65.2％(30／46)，外周血淋巴细胞MDR1阳性率为58.7％(27／46)，24例患者为肿瘤细胞和外周血淋巴细胞MDR1均阳性。复发患者阳性率为81.3％(26／32)，多程化疗患者阳性率为85.7％(24／28)，明显高于初治或未行化疗患者。阳性逆转组化疗有效率为46.7％(7／15)，对照组为20％(3／15)，阴性组为37.5％(6／16)，阳性逆转组的血液毒性和肝功能损害较其他组增高，其余毒副反应及免疫功能改变无明显差异。结论 RT-PCR法检测MDR1表达对评估NSCLC多药耐药、化疗疗效及预后具有一定临床价值。CsA对MDR1表达的逆转作用尚需扩大样本进行研究。
Expression of multidrug resistance gene and its reversion by cyclosporine in non-small cell lung cancer
ZHANG Xiaochun, QU Fengsheng, YUE Changqing, YANG Xiuxun, HONG Shiqiang, XU Gongli. Cancer Research And Treatment Center, Shandong Province Hospital, Jinan, Shandong 250021, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate relation between the multidrug resistance gene (MDR1) expression and chemotherapeutic response for non-small cell lung cancer (NSCLC) and to evaluate the effect of cyclosporine (CsA) on reversion of MDR1. Methods Cancer tissue specimens and peripheral blood samples were collected from 46 patients with NSCLC. MDR1 was amplified in total RNA extracted from cancer cell specimens and peripheral blood lymphocyte (PBL) by RT-PCR assay. According to the result of detection, some MDR1-positive patients were treated with CsA and anticancer drugs (reverse group), other MDR1-positive patients (positive control group) and MDR1-negative patients (negative control group) were treated with anticancer drugs alone. Results The MDR1 positive rate of cancer cells was 65.2％(30／46), and of PBL was 58.7％(27／46); twenty-four cases were MDR1-positive both in cancer cells and PBL. The positive rate of patients with recurrence was 81.3％(26／32); of untreated patients was 28.6％(4／14); of patients with multi-cycle chemotherapy was 85.7％(24／28); of patients with non-chemotherapy was 33.3％(6／18). The differences were significant (P＜0.01). The response rate was 46.7％(7／15) in reverse group and 20％(3／15) in positive control group and 37.5％(6／16) in negative control group. There were no significant differences in the toxicities and immunity changes except for hematological toxicity and impaired liver function between reverse group and other groups. Conclusion RT-PCR examination of MDR1 expression is useful for predicting response to chemotherapy and prognosis in NSCLC patients. MDR1-positive is associated with poor prognosis. The reverse effect of CsA for expression of MDR1 requires further clinical study.
【Key words】 Non-small cell lung cancer Multidrug resistant gene RT-PCR Cyclosporine
This work was supported by a grant from Key Task Project of Science and Technology from Shandong Province Science Committee (to Xu Gongli)(1999BB1DBA2).
化疗在肿瘤治疗中占据着不可替代的重要地位，然而肿瘤细胞对于化疗药物的内在性和获得性多药耐药（multidrug resistance, MDR）却往往造成化疗失败［1］。寻求逆转MDR的高效、低毒的抗药调节剂研究已成为国内外肿瘤学基础与临床研究的热点。目前已确定十余类药物有比较确切的逆转MDR疗效，其中环孢菌素类药物、钙通道阻滞剂及激素类药物进入了临床试用，但多限于血液恶性肿瘤的应用。我们以46例非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者肿瘤组织细胞及外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte, PBL）为样本，利用逆转录多聚酶链反应(reverse transcription--polymerase chain reaction, RT-PCR)检测MDR1的表达，结合患者对化疗药物的反应，分析多药耐药基因MDR1与化疗疗效之间的关系；根据检测结果，在化疗同时给予环孢菌素A（cyclosporine, CsA），观察CsA的疗效、毒性及对免疫功能的影响。
1 材料和方法
1.1 病例选择 全组男性30例，女性16例，年龄45～72岁，平均年龄56.6岁。全部患者均经临床及病理证实，鳞癌20例，腺癌14例，腺鳞癌7例，大细胞癌5例；32例为手术后或放化疗后复发，14例为ⅢB期和Ⅳ期的初治患者。所有患者均有可评价疗效的客观观察指标，KPS评分大于60分，预计生存期3个月以上，且无严重的心、肝、肾功能异常及明显化疗禁忌症。
1.2 检测方法
1.2.1 检测标本 化疗前分别采取患者外周静脉血1?ml并以肝素抗凝，经支气管镜取肿瘤组织活检或转移淋巴结活检，制备成细胞膜完整的单细胞悬液。
1.2.2 试剂 MDR1 RT-PCR药盒为北京师范大学北京京师生物工程技术公司产品。
1.2.3. 样品处理 ①从1ml抗凝外周血分离出白细胞，悬浮于25?ml生理盐水中；约1?mm×1?mm×1?mm的肿瘤组织匀浆后加100?μl生理盐水悬浮，取25?μl用于RNA提取；加100?μl裂解液A充分振荡，加入裂解液B 100?μl与50?μl氯仿，充分混匀，15?000?r／min下离心10?min；小心吸取上清50?μl，加60?μl预冷（－20℃）的异丙醇混合10?s；②15?000?r／min下离心10?min，去掉上清，短暂离心并彻底吸干残余液体；③80％乙醇离心洗涤一次，同前法除去液体，室温干燥3～5?min。
1.2.4 扩增反应 向样本管或阳性RNA管中加入20?μl MDR RTmix和1?μl Emix混匀，离心数秒，加2滴石蜡油，42℃保温30?min；按下列参数扩增35个循环：94℃／45?s，55℃／45?s，72℃／45?s。
1.2.5 检测结果判定 制胶：5?ml?50×TAE稀释至250?ml，0.4?g琼脂糖加20?ml?1×TAE熔化制胶；电泳：取10?μl扩增产物加于2％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察：同时出现548?bp和167?bp条带者为阳性，只出现548?bp条带则为阴性，若二种条带均不出现者表明模板提取过程中RNA发生降解，不能判断其阴阳性。
1.3 治疗方法
1.3.1 分组 根据RT-PCR检测结果将患者分成2组，MDR1阳性组为A组，阴性组为B组。A组再随机分2组：A1组为CsA逆转实验组，A2组为观察对照组。
1.3.2 化疗方案 化疗药物有异环磷酰胺(ifosphamide, IFO)，表阿霉素(epirubicin, EPI)，顺铂(cisplatin, DDP)和诺维本(navelbine, NVB)，方案为IEP（IFO＋EPI＋DDP）或NP方案（NVB＋DDP）。上述方案至少治疗2周期，间隔21～28?d。A1、A2和B组均应用上述方案。A1组于化疗前24?h开始服用CsA，直至化疗用药结束，剂量为4?mg／kg，化疗间歇期停止服药。
1.4 临床观察指标 46例患者治疗前后详细观察并记录临床症状、体征改善情况及不良反应，给予血常规、肝肾功能、免疫功能及心电图等有关影像学（X线、B超、CT或MRI）检查。
1.5 评价标准和数据处理 按照WHO 1981年统一评价标准，疗效分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD）。毒性分为0～Ⅳ度。数据处理采用χ2检验。
2 结果
2.1 检测结果 本组检测中未出现RNA降解者。46例患者中肿瘤细胞MDR1阳性表达者为30例，阳性率65.2％；阴性者16例，阴性率34.8％。PBL细胞MDR1阳性表达为27例，阳性率58.7％；阴性为19例，阴性率41.3％。24例患者表现为肿瘤细胞和PBL细胞MDR1均阳性。肿瘤细胞MDR1的表达与患者既往治疗、肺癌组织学类型间的关系见表1。
2.2 临床疗效 A1组获CR?2例，PR?5例，SD?6例，PD?2例，有效率为46.7％；A2组PR?3例，SD?7例，PD?5例，有效率为20％；B组CR?1例，PR?5例，NC?6例，PD?4例，有效率为37.5％。A1组与A2组的疗效虽然相差比较明显，但由于标本少，尚无统计学比较意义。B组疗效也高于A2组，但其差异无显著性。
2.3 毒副反应 由表2可见血液毒性在A1组较A2、B组重，肝功能损害(除胆红素)A1组明显高于A2、B组，而肾功能及心功能检查各组间无明显差别。消化道症状A1组略重于A2、B组；A1组部分患者应用CsA期间出现全身烧灼感、颜面部水肿，停用CsA后2或3?d消失。
2.4 对免疫功能的影响 表3显示A1组和A2组T细胞亚群和T4／T8值在化疗后比化疗前均有所下降，而A1组下降幅度较A2组大，但其差异无统计学意义。
表1 MDR1表达与患者既往治疗史、肺癌组织学类型间的关系
Tab 1 The relation between expression of MDR1 and treatment history
and histologic type of lung cancer
| Items |
n |
No. of positive case |
No. of negative case |
Positive rate |
P value |
| Treatment history |
| Recurrent patients |
32 |
26 |
6 |
81.3％ |
χ2＝9.71 |
| Untreated patients |
14 |
4 |
10 |
28.6％ |
P＜0.01 |
| Previous chemotherapy regimens |
| Multi-cycle |
28 |
24 |
4 |
85.7％ |
χ2＝13.25 |
| None |
18 |
6 |
12 |
33.3％ |
P＜0.01 |
| Histologic type |
| Squamous cell carcinoma |
20 |
12 |
8 |
60％ |
| Adenocarcinoma |
14 |
11 |
3 |
78.6％ |
χ2＝1.60 |
| Adenosquamous carcinoma |
7 |
4 |
3 |
57.1％ |
P＞0.05 |
| Large cell carcinoma |
5 |
3 |
2 |
60％ |
表2 三组患者不良反应比较
Tab 2 Comparison of the side effects and toxicity among the three groups
| Items |
Group A1(n＝15) |
Group A2(n＝15) |
Group B2(n＝16) |
| Grade
0 |
Grade
Ⅰ-Ⅱ |
Grade
Ⅲ-Ⅳ |
Grade
0 |
Grade
Ⅰ-Ⅱ |
Grade
Ⅲ-Ⅳ |
Grade
0 |
Grade
Ⅰ-Ⅱ |
Grade
Ⅲ-Ⅳ |
| Hematological toxicity |
| Erythrocytopenia |
6 |
6 |
3 |
8 |
6 |
1 |
9 |
6 |
1 |
| Leukopenia |
0 |
10 |
5 |
3 |
9 |
3 |
4 |
10 |
2 |
| Thrombocytopenia |
2 |
10 |
3 |
5 |
8 |
2 |
5 |
9 |
2 |
| Hepatic, renal and cardiac toxicity |
| Increased ALT |
10 |
5 |
0 |
12 |
3 |
0 |
12 |
4 |
0 |
| Increased AST |
12 |
3 |
0 |
13 |
2 |
0 |
11 |
5 |
0 |
| Increased AKP |
11 |
4 |
0 |
12 |
3 |
0 |
10 |
6 |
0 |
| Increased bilirubin |
8 |
7 |
0 |
12 |
3 |
0 |
12 |
4 |
0 |
| Increased BUN |
10 |
5 |
0 |
12 |
3 |
0 |
13 |
3 |
0 |
| CY |
9 |
6 |
0 |
11 |
4 |
0 |
13 |
3 |
0 |
| Proteinuria |
11 |
4 |
0 |
13 |
2 |
0 |
12 |
4 |
0 |
| Hematuria |
12 |
3 |
0 |
14 |
1 |
0 |
14 |
2 |
0 |
| Abnormal EKG |
14 |
1 |
0 |
14 |
1 |
0 |
14 |
2 |
0 |
| Non-hematological toxicity |
| Nausea and vomiting |
6 |
9 |
0 |
8 |
7 |
0 |
9 |
7 |
0 |
| Diarrhea |
12 |
3 |
0 |
13 |
2 |
0 |
12 |
4 |
0 |
| Stomatitis |
9 |
6 |
0 |
13 |
2 |
0 |
10 |
6 |
0 |
| Fever |
12 |
3 |
0 |
13 |
2 |
0 |
12 |
4 |
0 |
| Allergy |
10 |
5 |
0 |
14 |
1 |
0 |
14 |
2 |
0 |
| Skin |
13 |
2 |
0 |
14 |
1 |
0 |
14 |
2 |
0 |
| Alopecia |
0 |
12 |
3 |
0 |
13 |
2 |
2 |
13 |
1 |
| Mentality |
13 |
2 |
0 |
15 |
0 |
0 |
14 |
2 |
0 |
| Peripheral neuritis |
15 |
0 |
0 |
12 |
3 |
0 |
14 |
2 |
0 |
| Pain |
12 |
3 |
0 |
11 |
4 |
0 |
13 |
3 |
0 |
表3 三组肺癌患者化疗前后T细胞亚群和自然杀伤细胞活性的变化(
±s)
Tab 3 Changes of T-cell subsets and NK cell activity before and after chemotherapy in three groups(±s)
| Group |
No. of case |
Time |
CD3＋ |
CD4＋ |
CD8＋ |
CD4＋／CD8＋ |
NK |
| Group A1 |
15 |
Before chemotherapy
After chemotherapy |
57.8±5.3
51.9±6.5 |
32.7±7.0
24.2±7.1 |
39.2±6.4
36.3±8.1 |
0.90±0.22
0.78±0.17 |
18.2±5.1
14.6±6.1 |
| Group A2 |
15 |
Before chemotherapy
After chemotherapy |
57.6±5.2
55.1±8.1 |
31.2±7.1
29.1±8.8 |
34.0±6.3
33.2±7.9 |
0.89±0.20
0.87±0.29 |
18.4±5.2
16.6±6.1 |
| Group B |
16 |
Before chemotherapy
After chemotherapy |
59.3±8.6
56.4±7.2 |
37.7±7.5
32.5±6.4 |
29.0±6.4
28.7±5.6 |
1.27±3.10
0.87±0.29 |
20.2±5.2
19.3±4.5 |
3 讨论
MDR1基因扩增及其编码的P-gp过度表达被认为是多药耐药的主要原因［2］。目前已证明在人体大多数正常组织中MDR1基因是低表达的，在正常肺组织和血液系统呈阴性，在少数几种组织中，如肾上腺、肾脏、结肠等，则有高表达［3］。Goldstein等研究表明，在未治的NSCLC患者中MDR1呈低表达，在复发后可出现MDR1的高表达［2］。P-gp是耐药细胞膜上的一种糖蛋白，它可耗能将药物泵出细胞外，使细胞内的化疗药物达不到有效杀伤剂量而致耐药产生。在人外周血淋巴细胞中，P-gp也可出现在自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）、细胞毒性T细胞、抑制性T淋巴细胞、B淋巴细胞及少数Th淋巴细胞等细胞膜上，在药物的长期作用下，这些细胞的MDR1基因扩增，也使P-gp的表达增加。
我们的检测结果显示复发的NSCLC患者MDR1阳性率明显高于初治患者，多程化疗MDR1阳性率明显高于未行治疗者。文献报道肺癌的组织学类型与抗药性有相关性，腺癌中MDR1表达水平明显高于鳞癌［4］。而我们的结果显示腺癌MDR1阳性率虽高于其他组织类型，但无统计学意义。本组治疗结果显示MDR1阳性逆转实验组化疗有效率为46.7％，高于MDR1阴性组37.5％和MDR1阳性对照组20％的化疗有效率，但因病例数较少未进行统计学比较分析。然而这至少提示MDR1表达与临床上患者对化疗药物的敏感性之间有一定的相关性，可望为临床提供一个有意义的指标：临床医生可根据每个患者MDR1的表达情况，合理地制定化疗方案，包括选择化疗药物的种类、剂量及应用时机，使化疗发挥最有效的作用，避免与MDR有关的药物对患者造成的毒副作用，并为克服或逆转多药耐药性提供理论基础，同时也可能成为一个很重要的判断预后的参考指标。
CsA原是用于器官移植的免疫抑制剂，近年来，体外实验及动物模型中均显示其有高度逆转MDR的活性［5］。国内外学者报道［6］将CsA用于逆转血液恶性肿瘤的MDR取得显著疗效，可明显延长患者的中位生存期，而且毒副作用轻微，没有肾毒性或严重的心血管系统的副作用。将其用于逆转实体瘤的报道较少。国外学者［7～9］报道了将CsA和阿霉素及CsA和足叶乙甙逆转实体瘤MDR的Ⅰ期临床试验，显示CsA可以明显影响化学药物动力学，增加化疗有关的毒副作用，也有明显的逆转MDR作用。本研究结果显示应用CsA的逆转实验组化疗有效率高于两个对照组，毒副反应除血液毒性和胆红素高于对照组外，其他生化指标等不良反应与对照组无差异，对免疫功能的影响也差异不大。因此，CsA对MDR1表达的逆转作用尚需扩大样本进行研究。
CsA逆转MDR机理比较复杂，主要还是通过抑制MDR1基因的表达产生P-gp的跨膜泵而发挥作用，这已从许多体外实验及临床实验得到证实，但也有些学者观察到CsA逆转MDR时，并无抗药细胞株细胞内药物的蓄积增加，因此可能还有另外的机理［9］。有人报道［10］CsA（5.5?mg／ml）能逆转GM3639和P388／ADM的抗药性，使之恢复至敏感细胞的水平，其机理可能是使抗药细胞的膜电位升高以及作为P-gp的基质，竞争性影响MDR。另外，研究还发现CsA也能使正常组织及敏感细胞对化疗的敏感性增加，进一步说明CsA逆转MDR的机理至少不是唯一通过影响细胞内药物蓄积的机理。本研究受山东省科委科技攻关项目（1999BB1DBA2）资助
参 考 文 献
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(收稿：1999-11-01 修回：2000-02-21)
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