肺癌组织CD44和TSP-1基因表达与肿瘤进展的关系

中国肺癌杂志 2000年第3期第3卷 论著

作者：尤健　张熙曾　张建国　陈华　刘岩雪　孙丽

单位：尤健　张熙曾　张建国　陈华　刘岩雪　孙丽(300060　天津市肿瘤医院胸外科)

关键词：肺肿瘤；CD44H；CD44V6；TSP-1；免疫组织化学；RT-PCR

　　【摘要】　目的　研究肺癌组织中CD44和TSP-1的表达并分析其与患者临床预后的关系。方法　应用免疫组化法检测112例肺癌组织中CD44和TSP-1表达，其中25例标本同时用RT-PCR法检测TSP-1表达。结果　TSP-1在肺腺癌中的表达（74.36％）明显高于鳞癌和小细胞癌（47.17％，P＝0.03；35.71％，P＝0.02）。CD44_H及CD44_V6在小细胞肺癌中均表达极低；CD44_H在肺腺癌中的表达（61.54％）高于鳞癌（50.94％，P＝0.036），CD44_V6在肺鳞癌中的表达（50.94％）明显高于腺癌（17.95％，P＝0.003）。Kaplan-Meier生存分析发现，TSP-1、CD44_H 及CD44_V6均与肺癌患者生存情况无明显关系，但以病理类型进行分层分析后，在肺腺癌的表达中，低TSP-1表达组的生存率明显高于中／高表达组（Log Rank＝0.0163）。25例标本同时用免疫组化法及RT-PCR法检测TSP-1表达，两法符合率为84％（21／25），两法结果无显著性差异（P＞0.05）。结论　肺癌的TSP-1、CD44_H 及CD44_V6表达均有一定的病理学特异性。肺腺癌中TSP-1可能与患者的预后有关。TSP-1的免疫组化检测法能可靠地用于石蜡存档标本的检测。

Expression of thrombospondin-1 and CD44 in human lung cancer tissues and their prognostic significance

YOU Jian, ZHANG Xizeng, ZHANG Jianguo, CHEN Hua, LIU Yanxue, SUN Li. Department of Thoracic Surgery, Tianjin Cancer Hospital, Tianjin 300060, P.R.China

　　【Abstract】　Objective　To analyze the expression of CD44H, CD44V6 and TSP-1 in human lung cancer tissues and their prognostic significance. Methods　A total of 112 lung cancer samples were examined for CD44H, CD44V6 and TSP-1 expression by immunohistochemical staining. Moreover, 25 cases out of them were detected for TSP-1 by RT-PCR assay simultaneously. Results　Stronger expression of TSP-1 was demonstrated in adenocarcinomas (74.36％) as compared with squamous cell carcinomas (47.17％，P＝0.03) and small cell lung cancer (35.71％, P＝0.02). All of small cell lung cancer had significantly low expression of CD44H and CD44V6. Adenocarcinomas (61.54％) showed stronger CD44H membranous expression than squamous cell carcinomas did (50.94％，P＝0.036). Whereas, squamous cell carcinomas (50.94％) showed stronger CD44V6 membranous expression than adenocarcinomas did (17.95％, P＝0.003). Kaplan-Meier survival statistical analysis for 100 cases with complete follow-up data indicated that there was no significant relationship among TSP-1, CD44H, CD44V6 expression and overall survival rate. However, after stratifying by histopathological types, the overall survival rate of patients with low expression of TSP-1 was significantly higher than that of moderate／high expression groups in adenocarcinomas (Log Rank＝0.0163). Immunohistochemical and RT-PCR technique were utilized in 25 out of 112 cases simultaneously. The accordance rate of the two methods was 84％, and no significant difference was found between them. Conclusion　The expression of TSP-1, CD44H and CD44V6 is significantly related to histopathological types. TSP-1 expression might be a prognostic indicator in lung adenocarcinoma. TSP-1 can be detected reliably in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by immunohistochemical method.

　　【Key words】　Lung neoplasms　　CD44H　　CD44V6　　TSP-1　　Immunohistochemistry　　RT-PCR

　　This work was supported by a grant from the Scientific Fund of Tianjin Health Bureau(To You Jian)(98KYGG-20).

　　CD44是一种被各种细胞，包括肿瘤细胞广泛表达的细胞表面糖蛋白，作为细胞间的粘附分子参与细胞—基质、细胞—细胞之间的特异性粘附过程。凝血酶敏感蛋白（Thrombospondin-1,TSP-1）是一个多功能细胞基质糖蛋白，对细胞的生长、增殖、运动、血管形成以及肿瘤的转移等均有作用。二者的表达都与肿瘤转移有关。本研究应用免疫组化法综合检测112例肺癌组织中CD44和TSP-1的表达，并分析其与患者临床预后的关系，其中25例标本同时应用RT-PCR法检测TSP-1表达。

　　1　材料与方法

　　1.1　病例选择　全组112例标本取自1988年12月至1998年12月天津市肿瘤医院收治的经手术治疗的原发性肺癌患者。

　　1.2　免疫组织化学染色　采用SP法，SP试剂盒为VECTOR公司产品。小鼠CD44（HCAM）、CD44（V6）及TSP-1 (Ab-7)单抗分别为NOVOCASTRA公司、R&D 公司、NEOMARKER公司产品。预实验中的阳性组织切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。阳性判断标准：所有染色切片均经三位医师诊断，以全部取得统一结果为准。CD44_H、CD44_V6 DAB显色应呈棕褐色分布于细胞膜上，无背景着色，以阳性染色细胞占肿瘤细胞数（间质细胞除外）的5％以下、5％～50％、50％以上分别判定为＋、、。TSP-1?DAB显色应呈棕褐色、颗粒状、团块状或带状分布于细胞浆和细胞外间质中，无背景着色，以阳性染色细胞及间质占肿瘤细胞数及间质的5％以下、5％～50％、50％以上分别判定为＋、、。

　　1.3　RT-PCR法　采用TRIzol总RNA分离试剂（GibcoBRL公司），提取总RNA。取2?μg总RNA进行逆转录反应，然后取相当于200?ng RNA来源的cDNA为模板，分别进行β₂M 和TSP-1的RT-PCR。TSP-1扩增条件为：94℃?60?s,55℃?60?s,72℃?60?s，最后一次循环延时72℃?3?min，30个循环。反应体系中不加cDNA模板者为阴性对照。TSP-1的引物序列^［1］：5′-CGTCCTGTTCCTGATGCATG-3′(99-118)，5′-GGCAGGACACCTTTTTG-CAGA-3′(1115-1135)。

　　1.4　统计学处理　采用SPSS7.5统计软件进行数据处理。单因素分析：χ²检验、单因素方差分析、MCNEMAR非参数检验、Mann-Whitney非参数检验；多因素分析：COX回归分析；生存分析：Kaplan-Meier生存分析、Log Rank检验。检验水准：双侧α＝0.05。

　　2　结果

　　因大细胞癌、细支气管肺泡癌和恶纤组病例数过少，故不进行统计学分析。为便于统计学处理，我们进行生存分析时把“”和“”合并为一组。

　　2.1　TSP-1免疫组化染色结果及生存分析(表1，图1、2)　TSP-1在肺腺癌中的表达分别明显高于鳞癌和小细胞癌（χ²＝6.98，P＝0.03；χ²＝5.11，P＝0.02）。100例随访资料完整的病例，应用Kaplan-Meier生存分析发现：低表达（＋）组与中／高表达（／）组的生存率差异无显著性（Log Rank＝0.1599）。以病理类型进行分层研究发现，在肺腺癌的表达中，低TSP-1表达组的生存率明显高于中／高组(Log Rank＝0.0163)，低表达组的3年生存率为62.50％，中／高组为25.08％。 TSP-1与年龄、性别、病期、吸烟指数、术前是否化放疗以及肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期之间均无明显关系(P＞0.05)。

图1　肺鳞状细胞癌组织TSP-1 SP染色显微摄影图

　　Fig 1　Photomicrographs of paraffin-embedded tissue sections of squamous cell carcinoma stained with antibody to TSP-1

图2　39例肺腺癌患者TSP-1表达与生存率的关系

　　Fig 2　Relationship between the survival rate and TSP-1 expression in 39 patients with adenocarcinoma of the lung

表1　TSP-1、CD44_H、CD44_V6免疫组化染色结果

　　Tab 1　The results of TSP-1, CD44H, CD44V6 expression by immunohistochemical staining

Items	Sex		Age 　　(years)	Index of 　　smoking	Histology			Tumor size		Lymph node status		TNM stage			Preoperative therapy
	Male	Female			SCC	AC	SCLC	T1＋T2	T3＋T4	N0	N1＋N2	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	With	Without
TSP-1
＋	34	16	55.18	378.70	28	10	9	38	12	24	26	22	12	16	13	37
	16	14	58.10	208.83	10	13	5	23	7	7	23	7	8	15	4	26
	14	18	57.79	419.69	15	16	0	26	6	15	17	12	7	13	5	27
CD44H
＋	43	15	54.97	352.76	26	15	14	47	11	24	34	22	15	21	15	43
	15	17	58.63	388.75	20	10	0	21	11	11	21	8	8	16	6	26
	6	16	58.23	260.45	7	14	0	19	3	11	11	11	4	7	1	21
CD44V6
＋	40	37	55.95	304.03	26	32	14	63	14	29	48	26	20	31	17	60
	14	10	57.54	395.83	16	7	0	16	8	11	13	9	6	9	4	20
	10	1	59.64	520.00	11	0	0	8	3	6	5	6	1	4	1	10

　　sCC: Squamous cell carcinoma; AC: Adenocarcinoma; SCLC: Small cell lung cancer2.2　CD44_H、CD44_V6免疫组化染色结果及生存分析（表1，图3、4）　CD44_H、CD44_V6在小细胞肺癌中不表达或表达极低。CD44_H在肺腺癌中的表达明显高于鳞癌（χ²＝6.643，P＝0.036）。CD44_V6在肺鳞癌中的表达明显高于腺癌（χ²＝9.13，P＝0.003）。CD44_H、CD44_V6与年龄、病期、吸烟指数、术前是否化放疗、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期以及生存时间无明显关系(P＞0.05)。

图3　肺腺癌组织CD44_H SP染色显微摄影图

　　Fig 3　Photomicrographs of paraffin-embedded tissue sections of adenocarcinoma stained with antibody to CD44H

图4　肺鳞状细胞癌组织CD44_V6SP染色显微摄影图

　　Fig 4　Photomicrographs of paraffin-embedded tissue sections of squamous cell carcinoma stained with antibody to CD44V6

　　2.3　RT-PCR法检测TSP-1结果及与免疫组化法的比较　扩增TSP-1的电泳结果见图5。免疫组化法中的“＋”组相当于RT-PCR法中的“－”组，免疫组化法中的“”及“”组相当于RT-PCR法中的“＋”组。经MCNEMAR检验两法无显著性差异（P＝0.625），符合率为84％（21／25）。RT-PCR法检测的25例标本中，经统计学检验，TSP-1与年龄、病期、吸烟指数、性别、术前是否化放疗、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期以及病理类型之间均无明显关系（P＞0.05）。

　　3　讨论

　　TSP-1是一种分子量450?ku的糖蛋白，主要由血小板、肿瘤细胞、内皮细胞等分泌，存在于血浆和细胞外基质中。TSP-1由三条相同的靠二硫键连接的多肽组成，每条多肽链均由数种基本的结构域组成，这些形形色色的结构域与细胞表面受体及大分子物质如胶原等相互作用，介导了一系列复杂的细胞功能，包括：细胞粘附、迁移、浸润、增殖、血管形成等^［2］。

　　有关TSP-1与肺癌进展的关系国内外报道不多。本研究虽未发现肺癌组织的TSP-1表达与肿瘤大小、淋巴结转移以及TNM分期的相关性，但却发现TSP-1表达在不同组织学来源的肺癌组织中有明显差异，即腺癌＞鳞癌＞小细胞癌。现知TSP-1在许多肿瘤细胞包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌等中均能表达^［3，4］。有资料显示，TSP-1表达可能受癌基因和抑癌基因的调节，不同组织学来源的肺癌细胞可能因为癌基因或抑癌基因不同，其细胞受这些基因的调节也不相同，故生物合成TSP-1的能力也有所不同。另外，不同类型的肺癌细胞结合TSP-1的能力也不一样。因此，不同组织学类型的肺癌中TSP-1表达的差异是可以理解的。

图5　以β₂M为内对照，肺癌组织特异扩增产物TSP-1电泳结果。β₂M特异扩增带在114?bp处；TSP-1特异扩增带在1036?bp处。2、3、5：肺鳞癌组织；1、4：肺腺癌组织。

　　Fig 5　RT-PCR detection of TSP-1 in human lung cancer. Lane M：Marker; Lane 2,3,5：Squamous cell carcinomas; Lane 1,4：Adenocarcinomas.

　　关于TSP-1表达和肺癌患者预后的关系文献中尚未见报道。我们对本组随访资料完整的100例患者的生存时间进行了Kaplan-Meier生存分析，发现在全组肺癌患者中，TSP-1表达与肺癌患者的生存率无显著性差异；但如以病理类型进行分层分析，则发现在肺腺癌患者中，TSP-1低表达者有比中／高表达者更好的预后。研究发现，TSP-1具有调节血小板聚集、细胞粘附、运动、生长的功能，在低浓度时能抑制由碱性纤维蛋白生长因子（bFGF）诱导的血管内皮的生长和运动，减少内皮细胞的粘附和形成管状结构的能力，而在高浓度时其作用正相反^［5，6］。Tuszynski等^［7］证实了外源性增加TSP-1可促进ADP及凝血酶刺激的血小板聚集，特别是肿瘤细胞在毛细血管床滞留时尤为突出。由于TSP-1介导了肿瘤细胞与血小板结构的相互作用，导致血小板聚集，促进了肿瘤的血行转移。

　　CD44是一种具有广泛异质性的单链膜表面糖蛋白，参与细胞与细胞、细胞与间质之间的相互作用，在淋巴细胞归巢、血细胞生成、细胞移动及转移中起重要作用。已知CD44基因由10个组成型外显子和10个变异型外显子组成，含有不同变异型外显子编码序列的CD44称为CD44拼接变异体（CD44_V），而完全不含10种变异型外显子编码序列的CD44称为CD44标准型(CD44_H或CD44_S)^［8］。目前通过PCR技术在许多细胞系中已发现10多种CD44_V。在这些变异体中，CD44_V6的表达是非转移性大鼠胰腺癌细胞株获得转移潜能所必需的^［13］。CD44_H和CD44_V6与肺癌患者肿瘤进展状况及预后关系的研究近年来在国外有一些报道，认为CD44与肺癌的病理类型有密切关系，但与分期、复发率及生存率则无明显关系。

　　本研究结果显示，CD44_H及CD44_V6在小细胞癌中几乎不表达，CD44_V6在鳞癌中的表达高于腺癌，相反CD44_H在腺癌中的表达要高于鳞癌。CD44在不同组织学类型表达的特点可能与其组织学来源有关^{［10，11］}。支气管粘膜上皮及Ⅱ型肺泡上皮均表达CD44_V6，肺鳞癌常在支气管粘膜上皮的鳞状上皮化生基础上癌变，文献报道和本研究都证实了鳞癌可特异性地高表达CD44_V6。小细胞未分化癌有其独特的组织学来源——Kultschitzky细胞，属APUD系统，可能是其CD44表达缺失的原因。腺癌则来源于粘液腺的癌变。目前尚无CD44_H是否在支气管粘液腺中表达的资料，但本研究发现CD44_H在肺腺癌的表达明显高于鳞癌。CD44_H是细胞膜上主要的透明质酸受体，体外实验已经证实CD44_H可在含透明质酸的环境中促进肿瘤细胞的运动^［12］，而细胞外基质中富含透明质酸，这正是肿瘤外侵、血行转移的重要条件。研究发现CD44_V对透明质酸的亲合性远低于CD44_H^［13］。腺癌中CD44_H高表达也与肺腺癌较鳞癌易于血行转移的临床特点相符。

　　本研究有25例标本同时使用免疫组化法和RT-PCR进行TSP-1的检测，经统计学检验两法无显著性差异，符合率达84％。已有文献报道，免疫组化法能可靠地检测TSP-1，选择适宜的抗原修复条件是检测可靠性的关键^［14］。Grossfeld使用pH＝1的Tris-HCl缓冲液及微波炉高温加热的抗原修复条件，但我们在预实验中发现，经pH＝1的缓冲液处理后的切片染色后细胞结构完全毁坏，使基质和细胞难以区分，而用pH＝6的枸橼酸缓冲液则可使基质和细胞浆染色满意，故我们在正式实验中使用枸橼酸缓冲液、微波炉高温加热为标准抗原修复条件。手术切除的肿瘤组织多以石蜡包埋存档，TSP-1石蜡包埋标本免疫组化检测法的成功应用使TSP-1的检测能与患者的随访资料相结合，并了解其在组织中的存在部位，拓宽了TSP-1的研究范围。

　　本研究受天津市卫生局科技基金(98KYGG-20)资助

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（收稿：1999-11-11，修回：2000-02-28）