人肺癌组织中nm23-H1基因突变研究
中国肺癌杂志 2000年第3期第3卷 论著
作者：刘伦旭 周清华 孙芝琳 覃扬 石应康 孙泽芳
单位：刘伦旭 周清华 石应康 孙芝琳 覃扬 孙泽芳(华西医科大学基础医学院生化教研室)
关键词：肺肿瘤；nm23基因；基因突变；单链构象多态性分析；转移抑制
【摘要】 目的 探讨癌转移抑制基因nm23-H1在人肺癌中的突变情况，及其与肺癌发生、发展及转移的关系。方法 采用聚合酶链反应—单链构象多态性技术(PCR-SSCP)，对手术切除的45例肺癌组织和7例正常肺组织的nm23-H1基因的5个外显子进行突变分析。结果 在所检测的肺组织中，未发现nm23-H1基因纯合缺失。SSCP分析发现一例肺癌组织nm23-H1基因外显子1单链DNA迁移率发生改变。此例患者为晚期肺鳞癌，伴有纵隔淋巴结转移和恶性胸水。结论 本实验所检测的nm23-H1基因外显子部分的基因突变在肺癌中发生率低，nm23-H1基因突变可能与肺癌进展及转移有关。
Mutational analysis of nm23-H1 gene in human lung cancer by polymerase chain reaction--single strand conformation polymorphism
LIU Lunxu, ZHOU Qinghua, SUN Zhilin, QIN Yang, SHI Yingkang, SUN Zefang. Department of Thoracocardiac Surgery, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, P.R.China
【Abstract】 Objective To investigate the mutation of nm23 gene and its correlation with development, progression and metastasis of human lung cancer. Methods Polymerase chain reaction--single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) was employed for mutational analysis of the five exons of nm23-H1 gene in 45 surgically resected lung cancer and 7 normal pulmonary tissues. Results In the examined DNA samples of pulmonary tissues, no homozygous loss of allele of nm23-H1 gene was observed. SSCP analysis revealed altered mobility of single stranded DNA of nm23-H1 exon 1 in one case of stage ⅢB squamous cell pulmonary carcinoma with mediastinal lymphnode metastasis and malignant pleural effusion. Conclusion The frequency of nm23-H1 gene mutation in its coding region is rare in lung cancer. Mutation of nm23-H1 gene might play a role in the progression and metastasis of lung cancer.
【Key words】 Lung neoplasms nm23 gene Gene mutation Single strand conformation polymorphism Metastasis suppression
This study was supported by a grant from the National Sciences Foundation of China (to Zhou Qinghua)(No.39470687)
nm23基因被认为是一种癌转移抑制基因，由美国国立癌症研究所的Patricia S.Steeg等于1988年在鼠K-1735黑色素瘤细胞系中发现［1］。在人类已发现四种nm23基因，其中研究较多的是nm23-H1和nm23-H2［2］。二者都定位于染色体17q21.3，长约9kb，呈串联排列，中间隔有4kb，每个基因含有5个外显子［3］。目前对nm23基因抑制癌转移的机理尚不清楚。有研究显示nm23-H1等位基因缺失与结肠癌的远处转移有关，也有在部分肿瘤中未检测到nm23基因改变的报道。我们已经研究了nm23基因在人肺癌中的mRNA转录、蛋白表达以及等位基因缺失［4～9］，为探讨nm23-H1基因在肺癌中的突变情况，及其与肺癌发生、发展及转移的关系，本研究采用聚合酶链反应—单链构象多态性技术(PCR-SSCP)在DNA水平对nm23-H1基因的5个外显子进行了突变分析。
1 材料与方法
1.1 组织标本 45例肺癌组织和7例正常肺组织来源于外科手术患者。包括鳞癌21例，腺癌20例，小细胞肺癌4例，其中25例伴有淋巴结转移，20例不伴有淋巴结转移。肺组织离体后放入液氮保存。患者诊断均有病理学证据，采用国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的分期标准。
1.2 PCR引物 根据GenBank Database (ACCESSION X75598)提供的nm23-H1基因全序列，参考Bafico等［10］的方案，设计扩增nm23-H1基因5个外显子的引物(表1)。
1.3 组织DNA的提取 根据常规的方法并有所改进。
1.4 PCR扩增 PCR反应系统组成为：5μl10×反应缓冲液，5μl2mmol／L4×dNTP(Sigma产品)，2μl2mmol／L上游及下游引物，100ng模板DNA，2.5UTaq酶(华美生物工程公司产品)，加超纯水至50μl。循环条件为：94℃变性1min，60℃～64℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次。
表 1 扩增nm23-H1基因外显子的PCR引物
Tab 1 PCR primers of nm23-H1 exons
| Exon |
Primer(5′3′) |
Expected size of
PCR product |
Annealing
temperature |
| 1 |
GTCTGAAAAACGTAGCGCCGG
CTTAGGTTTGAACTCCGGCTG |
217bp |
60℃ |
| 2 |
GCTTGAGACGGATGACGCTGTA
CAGGTTAATCACAGTGTTCTCC |
265bp |
64℃ |
| 3 |
ATGTCCTTAGATGGTTTGGGGGT
TTTGGTCTCATTCATGGCTGTAT |
252bp |
64℃ |
| 4 |
GCCACATTTTCTGCTGTGATT
CCCAAATCCTTGTGGCAACT |
234bp |
60℃ |
| 5 |
GTCTAATGTCCATGGAGCTTC
CAGATGGTCGGGGATGGTAAC |
400bp |
62℃ |
1.5 PCR产物的SSCP分析 根据Peng等［11］设计的高分辨率、低背景银染方法并有所改进。取PCR产物8μl，加3倍体积的SSCP变性液(98％甲酰胺，10mmol／LNaOH，20mmol／LEDTA，0.05％溴酚兰，0.05％二甲苯青)混匀后98℃变性5min，冰上骤冷，立即上样于6％～8％非变性聚丙烯酰胺凝胶，根据PCR产物DNA片段大小及凝胶浓度选择适当的电压及电泳时间，4℃恒压电泳。电泳结束后将凝胶在固定液(12％乙酸，50％甲醇，0.02％甲醛)中固定3～16h。用50％乙醇漂洗20min，2次。用新配制的0.02％硫代硫酸钠处理凝胶1min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次1min。银染液(0.2％AgNO3，0.03％甲醛)中染色35min(避光)。蒸馏水漂洗2次后，用新配制的显色液(6％Na2CO3，0.02％甲醛，0.0005％硫代硫酸钠)显色3～5min，在50％甲醇、16％乙酸中终止显色。照像记录结果。
2 结果
2.1 PCR扩增产物 以肺癌组织DNA为模板，分别对nm23-H1基因的5个外显子进行扩增，扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)。每个外显子的扩增产物都有一特异性带，片段大小与设计理论值完全相同。在所检测的45例肺癌组织中，扩增都获成功，并未检测到等位基因纯合缺失。
图 1 nm23-H1基因外显子1～5的PCR扩增产物琼脂糖电泳图
M：PBR322／HaeⅢ分子量参照物；E1～E5：外显子1～5
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products of nm23-H1 exon 1-5
M:PBR 322／HaeⅢ molecular marker; E1～E5: exon 1-5
图 2 nm23-H1基因外显子1 SSCP分析
8％聚丙烯酰胺凝胶，250V电泳5h。箭头所指为单链DNA迁移率发生改变。M：PBR322／HaeⅢ分子量参照物；Ca：癌组织；N：正常组织；ssDNA：单链DNA；dsDNA：双链DNA
Fig 2 SSCP analysis of nm23-H1 gene exon 1
Electrophoresis on 8％ polyacrylamide gel under voltage of 250V for 5 hours. Arrow indicated altered mobility of single strand DNA. M:PBR 322／Hae marker; Ca: Cancerous tissue; N:Normal tissue; ssDNA: single strand DNA; dsDNA: double strand DNA
2.2 SSCP银染分析 对nm23-H1外显子1～5的PCR扩增产物进行SSCP电泳及银染(图2～6)，在15号肺癌标本的nm23-H1基因PCR-SSCP分析中，观察到外显子1PCR扩增产物的单链DNA迁移率与正常对照相比发生改变(图2中箭头所示)。此例患者临床特征为：男性，57岁，左肺中心型中分化鳞癌，ⅢB期，肿块大小为8cm×6cm×6cm3，伴有纵隔淋巴结转移和300ml恶性胸水。其余4个外显子的PCR-SSCP分析均未发现迁移率改变。
图 3 nm23-H1基因外显子2 SSCP分析
8％聚丙烯酰胺凝胶，200V电泳15h
Fig 3 SSCP analysis of nm23-H1 gene exon 2
Electrophoresis on 8％ polyacrylamide gel under voltage of 200V for 15 hours
图 4 nm23-H1基因外显子3 SSCP分析
8％聚丙烯酰胺凝胶，250V电泳7h
Fig 4 SSCP analysis of nm23-H1 gene exon 3
Electrophoresis on 8％ polyacrylamide gel under voltage of 250V for 7 hours
图 5 nm23-H1基因外显子4 SSCP分析
8％聚丙烯酰胺凝胶，250V电泳7h
Fig 5 SSCP analysis of nm23-H1 gene exon 4
Electrophoresis on 8％ polyacrylamide gel under voltage of 250V for 7 hours
图 6 nm23-H1基因外显子5 SSCP分析
6％聚丙烯酰胺凝胶，220V电泳5h
Fig 6 SSCP analysis of nm23-H1 gene exon 5
Electrophoresis on 6％ polyacrylamide gel under voltage of 220V for 5 hours
3 讨论
本实验在DNA水平，通过PCR-SSCP研究了肺癌中nm23-H1基因突变情况。PCR-SSCP分析技术是80年代末期才建立的突变检测技术，此技术具有操作简便、快速、可靠等优点，对于小于200bp片段突变检出率达90％，400bp片段检出率约为70％～80％［12］。本研究采用了近年国外改进方法，其突出特点为高分辨率、低银染背景［11］。对小于250bp片段突变检出率达100％，大于300bp片段检出率为95％。在原方法中，聚丙烯酰胺凝胶含有琼脂糖成份，在本实验过程中，经摸索去掉了琼脂糖，使单链DNA迁移间距变化较原方法更明显，取得了很好的效果。
在所分析的45例肺癌中，发现一例ⅢB期肺鳞癌的nm23-H1基因外显子1发生了突变。关于nm23基因改变，Leone等［13］首先在109例不同肿瘤组织中发现64％的乳腺癌，42％的非小细胞肺癌，20％肾癌及22％结肠癌有nm23-H1等位基因缺失。Cohn等［14］前瞻性研究了21例结肠癌，发现nm23-H1等位基因缺失者远处转移发生率高，第一次显示了nm23-H1基因位点上的改变在肿瘤中具有预后意义。Wang等［15］在结肠癌的实验中也发现nm23基因改变主要发生在有肿瘤转移表型者。但也有在结肠癌、子宫内膜癌、甲状腺癌等肿瘤中未发现nm23基因突变证据的报道。在肺癌方面，周清华、陈军等［8，9］通过Southern印迹杂交观察到伴有淋巴结和／或远处转移的肺癌中nm23-H1等位基因缺失率显著高于不伴有转移的肺癌，低分化和未分化癌的nm23-H1等位基因缺失率亦显著高于中、高分化癌，显示nm23-H1等位基因缺失与肺癌转移有密切关系。本实验在研究等位基因缺失基础上通过PCR-SSCP研究nm23-H1基因外显子序列部分的基因突变，在45例肺癌中仅发现一例nm23-H1外显子1的基因突变，这说明本实验所检测的nm23-H1外显子部位序列基因突变在肺癌中发生率很低。此病例为肺癌晚期，伴有淋巴结转移和恶性胸水，这提示nm23-H1基因突变可能与肺癌进展及转移有关。此例突变可进一步用测序方法证实。
本课题受国家自然科学基金(39470687)资助
参考文献
1，Steeg PS, Bevilacqua G, Kopper L, et al. Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential. J Natl Cancer Inst,1988,80(3)∶200-206.
2，Stahl JA, Leone A, Rosengard AM, et al. Identification of a second human nm23 gene, nm23-H2. Cancer Res,1991,51(1)∶445-449.
3，Okada K, Urano T, Goi T, et al. Isolation of human nm23 genomes and analysis of loss of heterozygosity in primary colorectal carcinomas using a specific genomic probe. Cancer Res,1994,54(15)∶3979-3982.
4，刘伦旭，石应康，周清华.癌转移抑制基因：nm23的研究进展.中国胸心血管外科临床杂志，1995，2(1)∶48-51.
5，刘伦旭，周清华，石应康，等.癌转移抑制基因nm23在人肺癌中的转录表达研究.肺癌杂志，1999，2(1)∶1-4.
6，刘伦旭，覃杨，周清华，等.Northern印迹杂交分析nm23基因mRNA在人肺癌中的表达.中华肿瘤杂志，1998，20(5)∶342-344.
7，陈晓峰，周清华，石应康，等.转移抑制基因nm23-H1在人肺癌组织中的蛋白表达研究.中国胸心血管外科临床杂志，1997，4(2)∶89-92.
8，周清华，陈军，孙芝琳，等.nm23-H1等位基因缺失与人非小细胞肺癌转移相关性研究.中国胸心血管外科临床杂志，1998，5(3)∶131-134.
9，陈军，周清华，覃杨，等.人肺癌中nm23等位基因缺失的研究.中国肺癌杂志，2000，3(1)∶8-13.
10，Bafico A, Varesco L, De-Benedetti L, et al. Genomic PCR-SSCP analysis of the metastasis associated nm23-H1 gene: a study on colorectal cancer. Anticancer Res,1993,13(6A)∶2149-2154.
11，Peng H, Du M, Ji J, et al. High-resolution SSCP analysis using polyacrylmide agarose composite gel and a background-free silver staining method. Bio Techniques,1995,19(3)∶410-414.
12，Prosser J. Detecting single-base mutations. Trends Biotechnol,1993,11(6)∶238-246.
13，Leone A, McBride OW, Weston A, et al. Somatic allelic deletion of nm23 in human cancer. Cancer Res,1991,51(9)∶2490-2493.
14，Cohn KH, Wang FS, Desoto-lapaix F, et al. Association of nm23-H1 allelic deletions with distant metastasis in colorectal carcinoma. Lancet,1991,338(8769)∶722-724.
15，Wang L, Patel U, Ghosh L, et al. Mutation in the nm23 gene is associated with metastasis in colorectal cancer. Cancer Res,1993,53(4)∶717-720.
(收稿：1999-11-16 修回：2000-01-28)
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