人类第9号染色体微卫星改变与非小细胞肺癌发生及转移的关系

中国肺癌杂志 2000年第5期第3卷 论著

作者：张舒林　汤兵祥　梁庆正　李遂莹　何苡　杨丽萍

单位：张舒林(河南省胸科医院分子生物学研究室　郑州，450003)；汤兵祥(呼吸内科)；梁庆正　李遂莹　何苡(胸外科)；杨丽萍(河南省中医学院生化教研室)

关键词：非小细胞肺癌；染色体9p；微卫星标志物；聚合酶链反应

　　【摘要】目的　探讨人类第9号染色体短臂(9p)上微卫星改变与肺癌发生及转移的相关性。方法　应用聚合酶链反应(PCR)结合微卫星银染分析方法检测32例非小细胞肺癌(NSCLC)组织中两个微卫星标志物IFNA和D9S171的改变。结果　32例NSCLC患者中，14例(43.8％)出现了微卫星标志物改变。其中伴有淋巴结转移的肺癌组织中微卫星改变检出率为64.7％，不伴转移的肺癌组织中微卫星改变检出率为20％，两组间比较有显著性差异(P＜0.05)。16例良性肺部疾病组织均未检出微卫星改变。结论　人类第9号染色体微卫星改变在NSCLC中普遍存在，有可能成为肺癌早期诊断和转移判断的分子标志物。

　　【中图分类号】R734.2

Correlation of microsatellite alterations on chromosome 9 and oncogenesis,metastasis in NSCLC

ZHANG Shulin,TANG Binxiang,LIANG Qingzheng,LI Suiying,HE Yi,YANG Liping

　　(Laboratory of Molecular Biology,Henan Provincial Chest Hospital,Zhengzhou,Henan 450003,P.R.China)

　　【Abstract】Objective　To investigate the relationship among microsatellite alterations on chromosome 9(9p) and the oncogenesis,metastasis of non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods　Two microsatellite markers,IFNA and D9S171,were analyzed in 32 cases of NSCLC by polymerase chain reaction-based silver-staining assay.Results　Of 32 cases of NSCLC,14(43.8％) had microsatellite alterations.The alteration frequency was 64.7％ in NSCLC with lymph node metastasis,and 20％ in those without lymph node metastasis.There was significant difference between the two groups.None of benign lung tissues showed microsatellite alterations.Conclusion　Microsatellite alteration on chromosome 9p in NSCLC appears to be a common and specific event,and may be a valuable molecular marker for determination of early diagnosis and metastasis of NSCLC.

　　【Key words】Non-small cell lung cancer　　Chromosome 9p　　Microsatellite marker　　Polymerase chain reaction

　　微卫星是位于染色体上的2～6个核苷酸的串联重复序列，具有高度多态性，在肿瘤发生、发展中具有不稳定性，因而成为抑癌基因定位和等位基因丢失研究中很有价值的遗传标志物。本研究选择位于9p区域的微卫星标志物，应用PCR结合微卫星银染分析技术，检测32例NSCLC的手术切除标本，旨在探讨9p区域微卫星与NSCLC发生及转移的相关性。

　　1　材料和方法

　　1.1　标本　32例肺癌组织标本和远离癌灶的正常组织，来自本院手术切除的肺癌患者。按WHO分类标准，鳞癌17例，腺癌15例。按1997年UICC肺癌国际分期标准，ⅠA＋ⅠB期9例，ⅡA＋ⅡB期12例，ⅢA＋ⅢB期11例。淋巴结阳性者17例，淋巴结阴性者15例。此外，选取16例肺结核、肺囊肿等良性疾病的肺组织标本和远离病灶的正常组织标本作为对照。标本于手术后收集，立即置于液氮中保存。

　　1.2　DNA制备　参照Kishimoto等^［1］的方法，分离同一患者的肿瘤组织和非瘤组织，经蛋白酶K消化，酚／氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于TE液中，并经紫外分光光度计测定，将DNA浓度调整到每微升约50个细胞的DNA量。

　　1.3　微卫星测定　两个微卫星标志物IFNA(干扰素-α基因)和D9S171均为染色体9p上的二核苷酸重复序列(CA)n，其中IFNA位于端粒一侧，D9S171位于近着丝粒一侧。其引物序列分别为，IFNA，5′-TGCGCGTTAAGTTAATTGGTT-3′；5′-GTAAGGAAACCCCCACT-3′和D9S171，5′-TAAGTGAACCTCATCTCTGT-3′；5′-GCTAACAAATCATTAGGGAAA-3′，引物由赛百盛公司合成。PCR反应总体积为50?μl，含20?mmol／L Tris(pH 8.3)，50?mmol／L KCl，1.5?mmol／L MgCl₂，200?μmol／L dNTPs，0.01％明胶，0.5?μmol／L引物，1?U Taq DNA聚合酶(晶美公司产品)，和2?μl模板DNA(约100个细胞)。扩增条件为94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，共35个循环，反应在Perkin-Elmer-480型DNA热循环仪中完成。取10?μl扩增产物，加等量变性上样液(95％甲酰胺，20?mmol／L EDTA，0.05％溴酚兰，0.05％二甲苯腈FF)，热变性10分钟，于6％变性聚丙烯酰胺凝胶(含7?mol／L尿素)，60?W，电泳2～3小时，以Beidler银染色^［2］显示DNA条带。

　　1.4　微卫星改变判断　微卫星改变可分为两类：杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)和微卫星不稳定性(microsatellite instability,MI)。以正常组织的主条带(通常为2个区带)为标准，若肿瘤组织中DNA丢失一个区带，或相对密度减少50％以上，则为LOH；若肿瘤组织中DNA出现等位带的移动或额外的条带时，为MI。

　　1.5　统计学处理　以小样本χ²检验的校正公式对试验结果进行统计学分析。

　　2　结果

　　2.1　微卫星改变情况(图1、2)　检测32例NSCLC组织标本，14例(43.8％)在IFNA和(或)D9S171位点上发生了LOH和(或)MI等微卫星改变。16例肺部良性疾病标本均未检出微卫星改变。检出微卫星改变的病例中，35.7％(5／14)仅出现LOH，50％(7／14)仅出现MI，有2例(14.3％)在IFNA和D9S171两位点同时出现LOH和(或)MI。

　　2.2　微卫星改变与NSCLC临床病理特征的关系(表1)　组织类型和病理分期与微卫星改变无明显关系(P＞0.05)。不伴有淋巴结转移的肺癌组织微卫星改变发生率为20％(3／15)，伴有淋巴结转移的肺癌组织的微卫星改变检出率为64.7％(11／17)，两组间比较差异有显著性(χ²＝4.78，P＜0.05)。

　　3　讨论

图 1　IFNA部位的PCR产物电泳图谱(银染)

　　Fig 1　Electrophoresis of PCR products in paired normal control(N) and tumor(T) DNA on locus of IFNA (silver staining).

图 2　D9S171部位的PCR产物电泳图谱(银染)

　　Fig 2　Electrophoresis of PCR products in paired normal control(N) and tumor(T) DNA on locus of D9S171 (silver staining).

表 1　微卫星改变与NSCLC临床病理特征的关系

　　Tab 1　Relationship between microsatellite alteration

and clinicopathological characteristics of NSCLC

　　肺癌的形成经历了一个较为漫长的癌前发育阶段，对于起源于支气管粘膜上皮的鳞癌、小细胞癌等，癌变从组织形态上可分为上皮增生、化生、发育不良、原位癌和浸润癌，最终形成转移癌^［3］。对于起源于粘膜和细支气管以及肺泡等前体细胞的大多数腺癌和大细胞癌，尽管对其癌前阶段的形态发生了解相对较少，但似乎同样经历了细胞增生和发育不良等阶段^［4］。伴随形态学改变，癌前细胞出现了一系列遗传学上的变化，包括细胞水平上的染色体片段丢失和易位重排，分子水平的癌基因激活和抑癌基因失活等。Minna^［5］首先从分子水平提出了肺癌发生、发展的演变模式，即在癌前的最早阶段——细胞增生期，先出现3p部位某些等位基因丢失，接着位于9p上的一定区域出现基因丢失，最后，由于ras基因突变、激活和p53基因突变、丢失而失活，导致肿瘤形成。

　　Kishimoto^［1］应用PCR-LOH方法检测癌变不同阶段的9p LOH，在细胞增生期、发育不良等阶段，9p LOH检出率分别为38％和80％，在原位癌、浸润癌、转移癌阶段9p LOH检出率均达100％。Field等^［6］运用多个微卫星标志物检测45例NSCLC，发现58％的病例出现9p部位的微卫星改变。Shiseki等^［7］应用RFLP技术检测23例Ⅰ期原发肺癌患者和22例有脑部转移的肺癌患者，发现3p等区域在两类肺癌人群中均出现较高的丢失率(＞60％)，而9p等区域仅在发生脑转移的肺癌人群中检出较高的丢失率(＞60％)，与原发肺癌患者的检出率有显著性差异(P＜0.05)。以上研究结果说明9p部位的等位丢失和微卫星不稳定性与肺癌的发生和发展密切相关，并提示在缺失区域可能有抑癌基因存在。目前已在9p21和9p22两个区域分别克隆和鉴定出CDKN2(又称MTS1)和IFNA等基因^［1］，它们与肿瘤的发生和转移的具体机制正在进一步研究之中。我们应用9p上的两个微卫星标志物IFNA和D9S171检测32例NSCLC，发现43.8％的病例出现了微卫星标志物的特异性改变，而16例良性肺部病变组织均未检出微卫星改变。组织类型和病理分期与9p部位的微卫星改变无相关性。而伴有淋巴结转移的肿瘤组织微卫星改变检出率(64.7％)高于未伴转移的肿瘤组织(20％)，二组间有显著性差异(P＜0.05)。结果表明中国人NSCLC的发生及转移与9p部位的遗传物质变异密切相关。9p部位的微卫星是检测和判断NSCLC发生与转移的很有价值的遗传标志物。

　　早期运用细胞遗传学(CG)分析技术研究染色体丢失与肺癌发生的相关性，该方法过程复杂、费时、精确度低。分子生物学技术RFLP的使用，提高了染色体检测的精细程度，然而由于需要进行分子杂交和同位素检测，也较为繁杂，并且受限于RFLP信息量，诊断率低。近年来，PCR技术的引入和微卫星标志物的发现，使对染色体丢失等遗传物质改变的分析更为精确、灵敏和快捷^［1］，然而由于采用同位素检测，又大大限制了其在基础实验室的应用。本研究采用PCR结合二核苷酸(CA)n串联重复序列多态性分析，并引入银染技术进行检测，不仅具有接近同位素标记的灵敏度，又有周期短、效果好、成本低和安全可靠等优点，有利于该检测技术在临床实验室中应用和推广。

　　总之，9p部位微卫星改变是迄今已知的在肺癌发生中频度较高且出现最早的遗传物质变化之一^［8］，且与肺癌转移的发生密切相关，因而关于9p微卫星标志物的深入研究，不仅有助于进一步揭示肺癌发生、发展的详细机制，也将筛选出应用于肺癌早期诊断、预后判断和指导治疗的分子指标。

　　本研究受河南省科技攻关计划项目(981170835)资助

　　参考文献

　　1，Kishimoto Y,Sugio K,Hang J.Allele-specific loss in chromosome 9p loci in preneoplastic lesions accompanying non-small cell lung cancers.J Natl Cancer Inst,1995,87(16)∶1224-1229.

　　2，Beidler TL.Ultrasensitive staining of nucleic acid with silver.Ann Biochem,1982,126(2)∶373-374.

　　3，Auerbach O,Hammond FC,Garfinkel L.Changes in bronchial epithelium in relation to cigarette smoking,1955-1960 vs 1970-1977.N Engl J Med,1979,300(4)∶381-385.

　　4，Weng S,Tsuchiya E,Satoh Y,et al.Multiple atypical adenocarcinomas hyperplasia of type Ⅱ pneumonocytes and bronchiolo-alveolar carcinoma.Histopathology,1990,16(1)∶101-103.

　　5，Minna JD.Tumor suppressor genes and oncogenes in lung cancer: Potential clinic applications.Adv Oncol,1996,12(1)∶3-4.

　　6，Field JK,Neville EM,Stewart MP,et al.Fractional allele loss date indicate distinct genetic populations in the development of non-small cell lung cancer.Br J Cancer,1996,74(12)∶1968-1974.

　　7，Shiseki M,Kohno T,Adachi J,et al.Comparative allelotype of early and advanced stage non-small cell lung carcinoma.Genes Chromosomes Cancer,1996,17(2)∶71-77.

　　8，Wistuba I,Lam S,Behrens C,et al.Molecular damage in the bronchial epithelieum of current and former smokers.J Natl Cancer Inst,1997,89(18)∶1366-1373.

收稿日期：1999-11-29

修回日期：2000-04-25