小鼠肺癌B₇融合细胞的制备及生物学性质

中国肺癌杂志 2000年第6期第3卷 论著

作者：林苹　陆燕蓉　张洁　黄孝忠　江映红

单位：华西医科大学附属第一医院肿瘤中心肿瘤研究所　成都，610041

关键词：肺癌融合细胞；B7分子表达；构建；生物学性质

　　【摘要】目的　改善肿瘤细胞共刺激分子B₇的表达。方法　将ALA₉₇₀₂肺癌细胞与活化的B淋巴细胞用聚乙二醇进行细胞融合，经ELISA及免疫细胞化学筛选后，用S-P免疫细胞化学染色观察融合细胞的肺癌抗原及B₇分子的表达，并观察融合细胞的体内外生长情况。结果　经筛选获得一株融合细胞FLB_2C。融合细胞既表达肺癌抗原，又表达B₇分子。体外培养显示其贴壁性较ALA₉₇₀₂肺癌细胞减弱，生长明显变缓，细胞倍增时间延长，不能在软琼脂中形成集落。接种融合细胞亦不能在小鼠体内成瘤，而接种ALA₉₇₀₂细胞的10只小鼠中6例腋下出现肿瘤生长，3例还发生肺转移。结论　通过细胞融合方法可以有效改善肿瘤细胞的B₇分子表达，从而提高肿瘤细胞的抗原性。融合细胞FLB_2C的致瘤性明显减弱，为制备更有效的肺癌疫苗奠定了基础。

　　【中图分类号】Q813

Establishment and growth characteristics of mouse lung cancer B₇ fusion cells

LIN Ping,LU Yanrong,ZHANG Jie,HUANG Xiaozhong,JIANG Yinghong

　　(Cancer Institute and Cancer Center,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu,Sichuan 610041,P.R.China)

　　【Abstract】Objective　To ameliorate expression B₇ molecule of tumor cell.Methods　Mouse lung cancer cell line ALA₉₇₀₂ and active B lymphocytes were fused by polyethylene glycol.After screening with ELISA and immunocytochemistry,the expression of lung cancer antigen and B₇ molecule in the fusion cells were monitored by S-P immunocytochemistry staining.Proliferation of the fusion cells was observed in vitro and in vivo.Results　A fusion cell line,FLB_2C,was obtained through screening.FLB_2C could express the lung cancer antigen and B₇ molecule.The results of in vitro culture showed that the wall adherence characteristic of FLB_2C was abated and the growth of FLB_2C was slower than that of ALA₉₇₀₂.The cell multiplication time of FLB_2C prolonged and no colony was formed in soft agar.No tumor mass was observed in vivo after inoculation of FLB_2C into mice.Conclusion　Expression of B₇ molecule in tumor cell can be ameliorated through cell fusion,thereby antigenicity of tumor cell will be raised.The oncogenicity of FLB_2C is obviously weakened through fusion with normal cells.This provides the basis for preparation of better lung cancer vaccines.

　　【Key words】Lung cancer fusion cell　　Expression of B₇ molecule　　Establishment　　Biological feature

　　近年来，对肿瘤疫苗的研究成为了肿瘤免疫治疗的一个热点，其中最关键的是改善肿瘤细胞的共刺激分子表达以提高肿瘤免疫源性。以往的疫苗细胞不能十分有效地刺激机体产生保护性免疫反应的重要原因之一是肿瘤细胞多数低表达或不表达 B₇分子^［1］，即缺乏 T细胞免疫应答所需的共刺激信号。我们将小鼠肺癌细胞与活化的B淋巴细胞融合，观察到融合细胞既能表达肺癌抗原又能表达B₇分子，且其生物学性质有所改变。现将该实验报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂和材料　HAT培养液为Sigma产品，用含15％小牛血清的1640培养液制成终浓度为次黄嘌呤（H）1×10^－4?mol／L、氨基喋呤（A）4×10^－7?mol／L、胸腺嘧啶（T）1.6×10^－5?mol／L。RPMI1640培养液为Gibco BRL产品，含15％小牛血清、100?μg／ml青霉素和100?μg／ml链霉素。聚乙二醇（PEG）为Merck产品，分子质量为4?000?u，使用浓度为50％。MAb B₇购自Parmagen公司。LPS购自Difco公司。ALA₉₇₀₂细胞为我所建立的HGPRT缺陷的小鼠Lewis肺癌细胞株^［2］，常规培养于1640培养液中。兔抗ALA₉₇₀₂抗体（RαA）和兔抗小鼠活化B淋巴细胞抗体（RαB）由本所接常规方法制备。昆明小鼠由华西医科大学动物实验中心提供。

　　1.2　细胞融合制备疫苗　自昆明小鼠脾细胞中分离B淋巴细胞，用LPS（17?μg／ml）刺激培养3天，收集其细胞制成细胞悬液作融合用。将ALA₉₇₀₂细胞与小鼠活化的B淋巴细胞以1∶10比例混合，经50％PEG融合后，用HAT培养液在37℃、5％ CO₂下培养于96孔板中。10天时，对照ALA₉₇₀₂细胞死亡，换用HT培养液培养一周，再用1640培养液常规培养，用RαA和RαB抗体通过ELISA法测定上清液中相应的反应值进行初筛，选择二者反应均高（即光密度OD值高）且生长良好的细胞进行扩增，作有限稀释克隆，进一步用MAb B₇ S-P免疫细胞化学染色筛选法选择强阳性细胞扩增，将其作为疫苗细胞。

　　1.3　S-P免疫细胞化学染色　将细胞悬液制成细胞涂片，用4℃丙酮固定10分钟，1％ BSA封闭后，滴加MAb B₇ 5?μg／ml，4℃过夜，按常规进行S-P免疫化学染色，在光镜下观察，以棕黄色为阳性反应。

　　1.4　疫苗细胞肺癌抗原及B₇分子的表达　疫苗细胞增殖传代后，制成涂片，分别用RαA、MAb B₇进行S-P免疫细胞化学染色。

　　1.5　疫苗细胞的生长曲线及倍增时间　在光镜下观察细胞形态，常规台盼兰排染法测定活细胞数，绘制生长曲线。细胞倍增时间以下列公式计算：

Td＝　T lg2

　　lg　N

　　N₀

　　其中Td为倍增时间（小时），N₀为起始细胞数，N为终止细胞数，T为从N₀到N的时间。

　　1.6　软琼脂培养实验　将疫苗细胞和ALA₉₇₀₂细胞分别以每平皿500个细胞接种于含0.24％琼脂糖的培养皿中，每株细胞重复3个培养皿，在37℃、5％ CO₂中培养15天，以大于20个细胞数的集落记录，镜下计数每平皿各细胞株的集落数。

　　1.7　体内成瘤实验　疫苗细胞和ALA₉₇₀₂细胞分别按每只3×10⁶细胞皮下接种于20?g左右的昆明小鼠右前腋下，以生理盐水为空白对照，每组各10只，观察成瘤率及肺转移情况。

　　2　结果

　　2.1　疫苗细胞的建立　当ALA₉₇₀₂和活化的小鼠B淋巴细胞融合后，由RαA和RαB筛选出15孔反应强、生长良好的细胞，进一步克隆后用MAb B₇选择一株反应最强的细胞，将其作为疫苗细胞，命名为FLB_2C。

　　2.2　细胞体外生长情况　FLB_2C疫苗细胞呈圆形，为半贴壁生长，而且贴壁的细胞经轻微摇动即可掉下；ALA₉₇₀₂细胞亦为贴壁生长，但在传代后期多呈短梭形状且贴壁紧密。FLB_2C和ALA₉₇₀₂细胞倍增时间分别为46.82和28.41小时。两株细胞的生长曲线见图1，图中显示FLB_2C细胞生长明显变缓。

图 1　FLB_2C和ALA₉₇₀₂细胞株的生长曲线

　　Fig 1　Growth curves of FLB_2C and ALA₉₇₀₂ cell lines

　　2.3　融合细胞肺癌抗原及B₇分子的表达　S-P免疫细胞化学染色显示ALA₉₇₀₂细胞仅表达肺癌抗原，不表达B₇分子，而FLB_2C细胞则既表达肺癌抗原，又表达B₇分子，B₇分子主要分布在细胞膜及细胞浆(图2)。

图 2　FLB_2C细胞株表达B₇分子的S-P免疫细胞化学染色

　　Fig 2　MAb B₇ S-P immunocytochemistry staining of FLB_2C cell line

　　2.4　软琼脂集落形成情况　FLB_2C、ALA₉₇₀₂细胞株在软琼脂平皿中每皿集落数分别为0和169，有显著性差异（P＜0.01)。

　　2.5　体内成瘤情况　ALA₉₇₀₂组中有6只小鼠腋下出现肿瘤生长，3只还发生肺转移，病理切片显示生长的肿瘤呈腺癌；而FLB_2C组和生理盐水组小鼠仅在接种部位有轻度炎症反应，未见肿瘤细胞。

　　3　讨论

　　T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要机制。随着对抗原的识别和提呈，以及T细胞激活等免疫应答机理认识的不断深入，人们已经认识到有效的抗肿瘤免疫反应必需有共刺激信号的参与，将肿瘤抗原多肽提呈给T细胞而激发 T细胞的免疫应答^［3］。 B₇分子是共刺激分子中最重要的，然而大多数肿瘤细胞缺乏或低表达B₇分子，因而不能诱导有效的抗肿瘤免疫应答。克服这一缺陷，改善疫苗细胞B₇的表达，从而提高疫苗效果，这亦成为研究肺癌疫苗的热点之一。

　　有学者报道，用灭活的肺鳞癌细胞作疫苗，在手术后进行疫苗治疗，仅有甚微的效果，且有一定的盲目性。如何修饰、改造肺癌疫苗以提高其诱导特异性免疫治疗效果成了当前疫苗研究的重点。将基因导入Lewis肺癌，再用于胸膜腔注射，收到了较好的效果。Kato等报道，将B₇分子和IL-12基因导入Lewis肺癌细胞，比单独基因导入的瘤苗诱导的细胞毒性淋巴细胞(CTL)活性强得多^［4］。国外研究的树突状细胞(DC)疫苗亦是基于DC能高表达B₇、MHC等分子。

　　基于以上实验结果，我们选用不表达B₇分子的Lewis肺癌细胞ALA₉₇₀₂与活化的B淋巴细胞融合，获得了既能表达B₇分子又有肺癌抗原表达的融合细胞FLB_2C，证实通过融合确能将共刺激分子B₇导入肿瘤细胞，改善了肿瘤细胞上缺乏B₇分子的状态，从而可能有效地激活T细胞免疫。这与Guo等^［5］的报道相似，他们将大鼠的肝癌细胞与BSA活化的B淋巴细胞融合，获得阳性表达MHC、B₇、ICAM-1等表达的杂交细胞，并有较好的免疫预防肝癌的效果。

　　虽然细胞融合的方法简便、易操作，但在筛选过程中，由于B₇分子与细胞膜结合较紧，不易脱落，故要在细胞上检测到B₇分子的表达，才能确定是否真正具有B₇分子的表达。

　　另一方面，正常细胞与肿瘤细胞融合后，还可将正常细胞信息导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞生长趋向正常细胞。FLB_2C细胞的体外培养显示其形态及生长性质有所改变，呈生长缓慢趋势，在软琼脂中不能形成集落；接种FLB_2C细胞亦不能在小鼠体内成瘤。结果说明通过正常细胞与肿瘤细胞融合，可能改变亲代肿瘤细胞的一些生物学性质，由此构建的融合细胞将对肿瘤疫苗制备有潜在的应用价值。

　　本研究受国家自然科学基金（39800147）、卫生部基金（96-1-236）资助

　　参考文献

　　1，Gordon JF,Aronld SF,Jeffrey MS,et al.B₇,a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells.J Immunol,1989,143(8)∶2714-2717.

　　2，林苹，陆燕蓉，周宏远，等.抗8-氮鸟嘌呤小鼠肺癌细胞株ALA₉₇₀₂的建立.中国胸心血管外科临床杂志，1999，6（3）∶140-142.

　　3，Chen L,Linsley PS,Hellstrom KE.Costimulations of T cells for tumor immunity.Immunol Today,1993,14(10)∶483-486.

　　4，Kato K,Okumura K,Yagita H.Immunoregulation by B₇ and IL-12 gene trasfer.Leukemia,1997,11(Suppl 3)∶572-576.

　　5，Guo Y,Wu M,Chen H.Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells.Science,1994,263(5146)∶518-520.

收稿日期：1999-11-04

修回日期：2000-03-06