人肺癌离体组织多环芳烃类-DNA加合物的初步研究

中华肿瘤杂志 1998年第3期第0卷 基础研究

作者：谢汇江　赵志文　王苏民　孟庆海　张海青　李世业 陈肖嘉　贺锡文　杨柯　吕京　崔涛

单位：101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所（谢汇江、赵志文、王苏民、孟庆海、张海青、李世业、陈肖嘉）；中国预防医学科学院劳动卫生职业病研究所（贺锡文、杨柯、吕京、崔涛)

　　关键词： 肺肿瘤/病理学　　DNA加合物　　癌，鳞状细胞　　腺癌　　癌，小细胞　　病例对照研究　　吸烟

　　【摘要】　目的　探讨某些外在因素和体内多环芳烃类(PAH)-DNA加合物的量以及人肺癌三者的关系，以期评价环境的影响，发现高危人群。方法　从动物预初实验到临床病例对照研究, 以不同肺疾病行肺切除的患者为对象，采取Randerath的 ³²P后标记法。结果　测定动物肺标本中的PAH-DNA加合物的量(0.39，1.31，2.84)与苯并芘染毒剂量(6.25，20，40)之间有较好的剂量反应关系。加合物的量在女性肺癌组与肺良性疾病对照组之间差异有显著性(13.59∶7.90，P＜0.05)。女性从事烹调与否与加合物的量亦有明显差异(12.01∶6.41，P＜0.03)。另外加合物的量与病理学组织类型、细胞分化程度、淋巴结转移状况有关，如鳞癌明显高于腺癌等。结论　PAH-DNA加合物量高于肺良性病变对照，仅见于女性肺癌；加合物水平随肺癌分化程度下降、淋巴结转移而升高。

　　PAH-DNA adduct in human lung cancer explants. A preliminary study　　Xie Huijiang, Zhao Zhiwen, Wang Suming, et al. Beijing Research Institute for Tuberculosis and Lung Cancer, Beijing 101149

　　【Abstract】　Objective　To study the influences of external exposure on polycyclic aromatic hydrocarbons(PAH)-DNA adduct formation in lung cancer patients.Methods　On the basis of pilot experiments in mice，　³²P post-labeling assay developed by Randerath was used to measure PAH-DNA adduct in human lung tissue explants. Relative adduct label(RAL) value was employed as a measure of adduct formation. A case-control study was designed using age-, sex-, and residence-matched patients with lung cancer and benign pulmonary diseases.Results　Although the mean RAL value in male lung cancer patients was not significantly different from that in patients with benign diseases, patients who smoked cigarettes had significantly higher RAL value than those who did not smoke(27.62×10^-9 versus 11.42×10^-9, P=0.0015). In contrast, in female lung cancer patients, the RAL value was significantly higher in patients with lung cancer than in those with benign lung diseases (13.59×10^-9 versus 7.9×10^-9, P＜0.05). Moreover, significant difference in RAL values existed between female smokers and non-smokers. Cooking affected female patients only. Higher RAL values were seen in patients with squamous-cell carcinoma than with adenocarcinoma (P＜0.05). RAL values were significantly higher in poorly differentiated than in well-differentiated lung cancers (P＜0.05). A significant increase in RAL values was observed in patients with lymph node metastasis as compared with those without lymph node metastasis.Conclusion　PAH-DNA adduct level in lung tissue explants can be taken as a measure of environmental exposure and it correlates with the histological type, degree of differentiation and lymph node metastasis of lung cancer.

　　【Subject words】　Lung neoplasms/pathology　　DNA adducts　　Carcinoma, squamous cellAdenocarcinoma　　Carcinoma, small cell　　Case-control studies　　Smoking

　　随着分子生物学研究的进展,对煤烟型环境致癌物(包括吸烟)致癌作用的认识在不断深化。如多环芳烃类(polycyclic aromatic hydrocarbon，PAH)物质,在体内经代谢活化后与细胞的大分子DNA共价结合,形成PAH-DNA加合物。此加合物被认为在靶器官中可产生突变和致癌作用。体外和动物体内的实验表明，PAH-DNA加合物与肺癌发病有剂量反应关系^［1］。我们通过从动物试验到临床病例对照研究,以不同疾病的患者为对象,探讨外在因素和体内PAH-DNA加合物的量以及人肺癌发病三者的关系,以期达到评价环境因素的影响,发现高危人群及致癌物暴露反应关系。

材料与方法

　　一、动物试验

　　昆明种小鼠18～20 g,由中国医学科学院实验动物研究所提供，共20组(包括低、中剂量的反复试验)。将苯并芘(BaP)溶于100%二甲基亚砜(DMSO),配成浓度为5 mg/ml的溶液,分别以6.25，20，40 mg/kg体重剂量给小鼠腹腔注射染毒,对照动物以0.15 ml DMSO腹腔注射。24小时后,断脊处死动物,取0.1～0.2 g肺组织提取DNA，进一步测定PAH代表物BaP-DNA加合物的量。

　　二、病例对照研究

　　在北京市结核病胸部肿瘤研究所外科住院患者中,配对要求同性别、年龄±5岁、同居住区,选原发性肺癌即将肺切除病例，男女各20例为实验组；选同期住院非肺癌即将肺切除病例男女各20例为对照组。

　　入选病例于手术前按世界卫生组织建议制订的肺科环境性病因调查表和肺科情况调查表详细询问记录患者的一般事项、职业史与工害有关的暴露史、吸烟史、家庭肺癌史,既往肺部疾患史、烹调方式与家庭中吸烟人数等，对妇女要问月经史及妊娠分娩史等。

　　入选病例的肺标本和检验通知单由专人送交该所病理学研究室。取新鲜病灶及周围组织约1.5 cm×1.5 cm×3 cm放入液氮罐低温储存。定期移交中国预防医学科学院劳卫所分子毒理研究室进行DNA加合物的测定。标本其余部分放入福尔马林固定，留做病理检查。

　　1.病理学诊断∶由3位有经验的病理学医师负责。对原发性肺癌按1984年世界卫生组织规定的肺癌类型标准分型，并进一步判定细胞分化程度和有无淋巴结转移。

　　2.DNA的提取及PAH-DNA加合物的检测∶(1)DNA提取按常规。(2)PAH-DNA加合物³²P后标记：方法按文献［2］。(3)PAH-DNA加合物标记值(relative adduct label value，RAL)以10^-9表示,即在10^-9个核苷酸中有若干个加合物，计算公式：

　　RAL=(加合物 c/min数)/｛［γ-³²P］ATP比活性(每pmol的c/min)×点样用的DNA-P pmol数｝×100%

　　其中DNA-P pmol数=DNA 量(μg)×3240(pmol/μg)

　　3.统计分析∶应用IBM PC 386计算机，主要采用Epi inifo软件包中的广义线性回归模板(GLRM)，各项指标事先做数据化处理。统计标准如下:

　　(1)居住地划分:市区、城镇、农村、工业区。

　　(2)暴露状况：①主动吸烟是指1年内平均每日吸烟1支或以上；吸烟叶者1克折合香烟1支。吸烟又分现吸和既往吸：近1个月内一直继续在吸烟为现吸，近1个月以前已停止吸烟为既往吸。②烹调，按5年来平均每日做饭或做菜≥1次。③病理综合指数是取类型、分化程度、淋巴结转移的乘积。

结果

　　一、动物试验

　　对照组的RAL几乎不能测得。随着染毒剂量的增加(6.25，20，40 mg/kg)，小鼠肺组织内BaP-DNA加合物的量相应升高(0.39×10^-9，1．31×10^-9，2.84×10^-9)。经方差分析，F值为34，P值?0.01，可以认为有较好的剂量反应关系。两两t检验显示，差异有显著性，表明该方法具有良好的重复性。

　　二、病例对照研究

　　1.基本情况∶自1991年7月至1994年6月共收集84例肺标本，其中42例肺癌，另42例为非肺癌，按病例对照配对条件合格者74例(37对)。性别∶男19对，女18对。年龄∶肺癌组46．4±7.8岁，对照组45.9±9.0岁。居住地∶农村12对，占32.4％；城镇13对，占35.1％；市区12对，占32.4％。现吸烟率∶男55.3％，女11.1％。对照组不同肺疾患构成百分比：肺结核48.7％，支气管扩张21.6％，结核＋支气管扩张8.1％，肺囊肿8.1％，其他5.4％。肺癌类型构成百分比：鳞癌37.8％，腺癌37.8％，小细胞癌24.3％。

　　2.RAL量与有关因素的关系：结果见表1。(1)女性肺癌组的RAL高于对照组，差异有显著性。(2)女性吸烟与男性吸烟有同等的RAL(27.08∶27.62)，且均是有关因素中的最高者；两性吸烟与不吸烟比较，差异均有非常显著性。(3)女性烹调与否其RAL量差异有显著性。

　　3.RAL与肺癌病理学的关系：见表2。(1)RAL在非小细胞肺癌(NSCLC)中，鳞癌高于腺癌，差异有显著性。(2)RAL在NSCLC不同分化程度之间，差异有显著性。(3)RAL在NSCLC淋巴结转移与否，差异有显著性。(4)进一步分析NSCLC的RAL(自变量)与病理综合指数(应变量)的相关性，测定结果表明，r＝0.5925，t＝4.3511，P＝0.0001，有密切的相关性。

讨论

　　³²P后标记薄层层析技术是80年代国际环境化

表1　两性RAL与有关因素的关系(±s)

　　^* 女性肺癌组与对照组经控制了吸烟P值仍＜0.05　^**两性的吸烟与不吸烟经肺癌分层分析差异均有显著性　^***女性烹调经控制了吸烟及肺癌分层分析仍可见差异有显著性

表2　RAL(×10^-9)在肺癌病理学上的表达

　　^*小细胞癌在手术前均经化疗, 因此不进入对比分析学致癌研究取得的最引人注目的进展，其灵敏度可探测到10⁸～10¹⁰正常核苷酸中的1个DNA加合物^［3］。我们的动物试验结果显示有良好的重复性，有理由认为³²P-ATP后标记法具有敏感和进行生物监测的应用价值。

　　探索人肺癌组织PAH-DNA加合物量效关系，发现男女性之间的差别。女性肺癌组织RAL明显的高于对照组，意味着女性可能对PAH-DNA加合物有较高的敏感性，可为近年女性肺癌明显上升原因做出初步科学解释^［4］。目前女性肺癌引起普遍的关注，既往的肺癌流行病学资料表明，原男女性比值为8∶1或7∶1，近年成为2∶1或1∶1。这种性比值在我国亦相当突出，国内许多地方女性吸烟率仅在10％左右。日本和香港学者共同研究结果提示，在港华人妇女的肺癌发病率为世界各地之最^［5］。本研究的结果表明，影响女性肺癌形成的因素除吸烟外还有烹调。

　　吸烟是当前举世公认的影响肺癌发病的重要因素之一。我们提供吸烟者的RAL，无论男女，都是各项有关因素中之最。可是宏观流行病学者在吸烟影响问题中，对男女间的差别持不同意见^［4］。而本研究表明，男女的RAL几乎相等，但是体内靶器官中加合物的量，尚不能完全认为是肺癌发病的内因，致癌物在体内的作用，还往往受癌基因和抗癌基因的影响。香港华人妇女肺癌发病率为日本妇女的3倍，抗癌基因的突变显示明显的多^［5］。另有实验资料表明，女性吸烟引起抗癌基因突变的机会较高于男性^［6］，但体内致癌物的代谢与基因之间何为因果，尚需进一步研究。

　　我们的研究结果对肺癌的防治工作可起到一定的作用。如划分高危人群，提示男性应多注意吸烟;女性在注意吸烟的同时，尤应多注意烹调引发的煤烟、油烟等污染因素。干预措施亦就不应仅限于禁烟，对烹饪的性质、种类和消烟等亦应赋予足够的重视。

　　动物实验结果表明，BaP染毒与肺组织内RAL形成之间有良好的剂量反应关系，低、中剂量亦有重复性。临床病例对照研究结果表明，PAH-DNA加合物表达在女性肺癌和肺癌病理学有意义。

　　本课题受国家自然科学基金会及北京市自然科学基金会资助

参考文献

　　1Weston A, Bowman ED, Shields PG, et al. Detection of polycyclic aromatic hydrocarbon DNA adducts in human lung. Environ Health Perspect, 1993,99:25-27.

　　2Randerath K, Randerath E, Danna TF, et al. A new sensitive　³²P-post-labeling assay based on the specific enzymatic conversion of bulky DNA lesions to radiolabeled dinucleotides and nucleoside 5′-monophosphates. Carcinogenesis, 1989,10:1231-1235.

　　3van-Schooten FJ,Hillebrand MJ, van-Leeuwen FE,et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts in white blood cells from lung cancer patients: no correlation with adduct levels in lung. Carcinogenesis, 1992, 13:987-990.

　　4Bechett W S. Epidemiology and etiology of lung carcer. Clin Chest Med. New York: New York Print House.1993. 1.

　　5Takagi Y, Koo L C, Osada H, et al. Distinct mutational spectrum of the p53 gene in lung cancers from Chinese women in Hong Kong. Cancer Res, 1995, 55:5354-5357.

　　6赖百塘, 汪惠, 赵家棣，等. 突变p53蛋白在中国人非小细胞肺癌中的表达. 结核病与胸部肿瘤, 1993，增刊:11-13.

(收稿：1997-12-12　　修回：1998-01-14)