周围型肺癌CT征象与p53蛋白及增殖细胞核抗原表达间关系的研究

中华肿瘤杂志 1998年第5期第0卷 临床研究

作者：陈江浩　张洪新　黄学胜　王执民　刘锟　白建军

单位：710038 西安，第四军医大学唐都医院介入放射科［张洪新、(研究生)、陈江浩、王执民］，胸外科(刘锟)，放射科(白建军)；解放军第九一医院胸外科(黄学胜)

　　关键词： 肺肿瘤/放射摄影术　　肺肿瘤/病理学　　断层摄影术，X线计算机　　p53蛋白增殖细胞核抗原　　免疫组织化学

　　【摘要】　目的　研究周围型肺癌CT征象与p53蛋白及增殖细胞核抗原(PCNA)表达间的关系。方法　运用SP免疫组化法，检测32例经病理证实的周围型肺癌组织中p53蛋白及PCNA的表达, 并回顾性分析其与术前CT征象间的关系。结果　p53蛋白、PCNA表达与瘤体大小、深分叶征、空洞、胸膜凹陷征、 纵隔淋巴结转移有关,与毛刺征无关。结论　周围型肺癌CT征象中，瘤体直径＞3cm, 或出现深分叶征、空洞、 胸膜凹陷征、纵隔淋巴结转移者，具有相对更高的恶性程度, 肿瘤细胞的增殖更为活跃。

　　Study on the correlation between CT features and expression of p53 protein and PCNA in peripheral lung cancer　　Chen Jianghao, Zhang Hongxin, Huang Xuesheng, et al. Department of Interventional Radiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038

　　【Abstract】　Objective　To investigate the correlation between CT features and expression of p53 protein and PCNA in peripheral lung cancer. Methods　The expression of p53 protein and PCNA was examined by means of SP immunohistochemical technique in 32 cases of peripheral lung cancer proved by pathology; the relationship between the results and preoperative CT features was analyzed retrospectively. Results　The expression of p53 protein and PCNA was correlated with tumor size, deep lobulation, frank cavitation, pleural indentation and mediastinal lymph node metastasis, but not with spiculation. Conclusion　The CT features of peripheral lung cancer with diameter more than 3 cm, deep lobulation, frank cavitation, pleural indentation or mediastinal lymph node metastasis indicate higher degree of malignancy and proliferative activity of tumor cells.

　　【Subject words】　Lung neoplasms/radiography　　Lung neoplasms/pathology　　Tomography, X-ray computed　　p53 protein　　Proliferating cell nuclear antigen　　Immunohistochemistry

　　p53基因是一种重要的肿瘤抑制基因, 其突变与肿瘤的发生发展密切相关^［1］。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)也称周期蛋白(cyclin)，是反映细胞增殖分数和所处周期的客观指标, 亦可用于判断肿瘤的恶性程度及预后^［2,3］。近来, 有关周围型肺癌CT征象的研究不断深入, 现已从病理组织学逐渐过渡过到分子生物学水平, 并认为肿瘤的生长方式和增殖状态决定其影像表现^［4，5］。为此，我们对周围型肺癌CT征象与p53基因突变及PCNA表达间的关系进行了初步研究, 现报告如下。

材料与方法

　　1. 材料：随机收集本院胸外科1991～1995年周围型肺癌患者手术切除后存档蜡块32例。男24例,女8例。年龄33～73岁,平均56.2岁。无术前放、化疗史。全部病例经HE 染色光镜检查证实为肺癌,其中鳞癌11例,腺癌18例,小细胞癌3例。鳞、腺癌分化程度：高分化8例，中分化12例,低分化9例。全部标本常规切5 μm厚片备用。

　　2. 试剂：鼠抗人p53(D01)、鼠抗PCNA(Pc10)均为Zymed 生物技术公司产品;S-P试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

　　3. 染色方法：采用免疫组化SP法,具体操作按说明书方法进行。实验中设立空白对照,用PBS分别取代一抗或二抗,以已知乳癌阳性切片作p53 阳性对照,以大肠癌阳性切片作PCNA阳性对照。p53单抗工作浓度1∶100,PCNA单抗工作浓度1∶50。

　　4. 结果判定：以细胞核呈清晰棕黄色为阳性, p53阳性病例又按切片中阳性细胞所占比例分为3级: ＜25%为+, 25%～50%为++, ＞50%为+++。PCNA染色随机计数5个高倍视野约500个癌细胞,取平均阳性细胞率,分为Ⅰ～Ⅳ级:＜25%为Ⅰ级,≥25%、＜50%为Ⅱ级，≥50%、＜75%为Ⅲ级，≥75%为Ⅳ级。

　　5. CT技术：采用EIscint 2400型CT机,矩阵512×512,扫描时间2.1秒，层厚层距均为10 mm,病变区再用3～5 mm层厚薄扫。

　　CT征象的评定参照文献［6］进行，纵隔淋巴结转移以淋巴结短径≥10 mm为判定标准。

结果

　　32例肺癌组织中，p53蛋白阳性表达17例,阳性率53.1%。PCNA染色Ⅲ＋Ⅳ级共15例, 占46.9%。由表1可见，p53蛋白表达与肺癌组织学类型、分化程度无关；PCNA表达与肺癌组织学类型无关，与分化程度有关。由表2可见，p53蛋白、PCNA表达与肺癌CT征象中瘤体大小、深分叶征、胸膜凹陷征、空洞、 纵隔淋巴结转移有关, 与毛刺征无关(图1～3)。由表3可见，p53蛋白表达与肺癌细胞增殖状态有关。

讨论

　　肿瘤的发生与细胞增殖和分化过程中原癌基因的激活、 抑癌基因的失活密切相关。p53基因是肿瘤抑制基因家族中的重要成员之一,对细胞的分裂和增殖起负性调控作用,其突变则会刺激和促进细胞异常生长,导致肿瘤的发生^［1］。突变型p53蛋白半衰期延长,稳定性强,可通过免疫组化方法检出，

表1　肺癌组织类型分化程度与p53蛋白、PCNA表达的关系

　　注：(　)内为%

表3　p53蛋白表达与PCNA表达间的关系

　　注：p53蛋白阳性表达组，PCNA表达Ⅲ+Ⅳ级数显著高于阴性表达组，P＜0.05

　　而且p53蛋白的异常表达与p53 基因突变有良好的相关性^［7］，因此,可以认为，免疫组化检测阳性即提示突变型p53基因存在。 我们检测32例肺癌组织中p53蛋白的阳性表达率为53.1%,进一步证实p53基因突变与肺癌的发生发展有密切关系。此外,统计结果表明，p53蛋白表达与肺癌组织类型、分化程度无关(P＞0.05),与Hiyoshi等^［8］的研究结果基本一致，提示p53基因突变在肺癌发生中的普遍意义。

　　PCNA是真核细胞DNA聚合酶δ的辅助蛋白,在DNA复制中起重要作用。它主要合成于细胞周期的G₁/S期,M期降至最低水平,其量的变化与DNA合成一致,因此可作为评价细胞增殖状态的一项指标^［2］。Maeda等^［3］对胃癌组织的研究发现，PCNA阳性细胞比率＞50%者，其临床分期与预后明显差于50%以下者，在对乳癌、肝癌、肾盂输尿管癌的研究中也得到了相似的结果。本组32例肺癌组织，PCNA染色Ⅲ级10例, Ⅳ级5例, 共15例, 占46.9%。其在不同组织类型肺癌之间分布差异无显著性(P＞0.05), 但与肺鳞癌和腺癌的分化程度有关,低分化肺癌的PCNA染色Ⅲ＋Ⅳ级例数明显多于高、中分化肺癌(P＜0.05), 表明低分化肺癌组织的增殖能力明显增强。

　　本研究发现，瘤体最大直径＞3 cm组，p53蛋白阳性表达率及PCNA Ⅲ＋Ⅳ级表达率明显高于直径≤3 cm组(P值均＜0.05), 提示肺癌在3 cm大小时可能是其生物学特性发生转变的重要时期,即肿瘤处于由低度恶性向高度恶性转变的过程中^［9］。直径＞3 cm的肿瘤恶性程度大,增殖、转移能力强，预后差。刘进康等^［5］曾报道瘤体直径＞3 cm者DNA含量明显增高，这从另一角度论证了周围型肺癌大小与生物学特征间的相关性,并支持突变型p53基因可刺激细胞异常增殖的观点。

　　本组深分叶征(deep lobulation)肿瘤p53蛋白阳性表达率及PCNAⅢ+Ⅳ级表达率，非常显著地高于无深分叶征肿瘤(P值均＜0.01),提示深分叶征肿瘤具有更高的恶性生物学行为。Nowell^［9］的肿瘤细胞克隆演进理论认为:瘤组织内多数变异细胞并未存活下来，仅个别恶性度高、 增殖活跃的突变细胞经过克隆而形成几个相对独立的瘤细胞亚群,并由此导致肿瘤形态、密度的不均。这可能为本研究结果的理论基础。

　　统计分析显示, p53蛋白及PCNA表达与肿瘤边缘有无毛刺征(spiculation)无关(P＞0.05), 提示毛刺征的出现不说明肿瘤的恶性程度高。Zwirewich等^［10］报道肺内肿瘤周缘毛刺征的病理基础，主要是周围肺组织的不规则性纤维结缔组织增生反应(此现象亦可见于炎症、结核、 球孢子菌病等肺内良性结节), 其次才是肿瘤对周围血管、淋巴管的浸润。这可能为本研究结果的病理学解释。

　　本组资料中有5例患者出现癌性空洞(frank cavitation),其中鳞癌3例,腺癌及小细胞癌各1例, 符合以往空洞多见于鳞癌的研究报道^［6］。5例患者p53蛋白表达均为阳性,PCNA 表达Ⅲ级3例, Ⅳ级2例, 与无空洞组比较，差异均有显著性(P＜0.05, P＜0.01)。 提示出现空洞的肿瘤恶性程度高、生长迅速。

　　胸膜凹陷征(pleural indentation)指病灶与胸膜间的条索状致密影, 其粗细不均, 长短不一, 胸膜侧呈三角型, 尖端指向病灶。 病理基础为肿瘤阻塞血管或淋巴管导致瘤灶内纤维瘢痕形成, 并牵拉脏层胸膜内陷^［4,6］。本组资料中有胸膜凹陷征者11例, 其p53蛋白阳性表达率及PCNA Ⅲ＋Ⅳ级表达率显著高于无此征象组(P＜0.01, P＜0.05), 提示出现胸膜凹陷征的肿瘤恶性程度高。

　　有研究表明, 将直径1.0 cm作为正常淋巴结的上限, 判断纵隔淋巴结转移的敏感性为95%, 特异性为65%^［6］。故本实验选择以纵隔淋巴结短径≥10 mm为淋巴结转移阳性。结果表明，有纵隔淋巴结转移组p53蛋白阳性表达率及PCNA分级明显提高(P均＜0.05)，提示p53蛋白及PCNA 表达可能是反映肿瘤浸润转移能力的重要指标。

　　实验结果显示: p53蛋白阳性表达的肺癌组织PCNA分级显著高于阴性表达组(P＜0.05), 说明p53基因突变将刺激或促进肿瘤细胞的恶性增殖。Ebinam等^［11］在对非小细胞肺癌的研究中也取得了类似的结果。我们认为，联合检测p53蛋白和PCNA的表达，将有助于进一步认识肿瘤的产生与发展。

参考文献

　　1Levine AJ, Momand J, Fincay CA. The p53 tumor suppressor gene. Nature, 1991,351:453-456.

　　2Morris GF, Mathews MB. Regulation of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle. J Biol Chem,1989,264:1385-1386.

　　3Maeda K, Chung YS, Onoda N, et al. Proliferating cell nuclear antigen labeling index of preoperative biopsy specimens in gastric carcinoma with special reference to prognosis. Cancer,1994,73:528-533.

　　4Kuriyama K, Tateishi R, Doi O, et al. CT-pathologic correlation in small peripheral lung cancers. AJR,1987,149:1139-1143.

　　5刘进康, 曾纪珍, 周建华, 等. 周围型肺腺、鳞癌CT征象与癌细胞核DNA含量关系的研究. 中华放射学杂志,1996,30:15-19.

　　6曹丹庆, 蔡祖龙主编. 全身CT诊断学. 北京: 人民军医出版社,1996.326-367.

　　7Brambilla E, Gazzeri S, Moro D, et al. Immunohistochemical study of p53 in human lung carcinomas. Am J Pathol, 1993, 143: 199-210.

　　8Hiyoshi H, Matsuno Y, Kato H, et al. Clinicopathological significance of nuclear accumulation of tumor suppressor gene p53 product in primary lung cancer. Jpn J Cancer Res,1992,83:101-106.

　　9Nowell PC. Mechanisms of tumor progression. Cancer Res,1986,46:2203-2207.

　　10Zwirewich CV, Vedal S, Miller RR, et al. Solitary pulmonary nodule: high-resolution CT and radiologic-pathologic correlation. Radiol, 1991, 179:469-476.

　　11Ebinam E, Steibery SM, Mulsine JL, et al. Relationship of p53 overexpression and upregulation of proliferating cell nuclear antigen with the clinical course of non-small cell lung cancer. Cancer Res,1994,54:2496-2503.