肺癌胸水细胞8号染色体数目异常变化的研究

中华肿瘤杂志 2000年第1期第22卷 基础研究

作者：宁静　刘树范　程书均

单位：宁静（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，100021 北京）；刘树范（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，100021 北京）；程书均（中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，100021 北京）

　　关键词： 肺肿瘤；胸水；原位杂交；非整倍体

　　【摘要】　目的　探讨8号染色体数目改变在胸水肿瘤细胞检测中的应用。方法　利用8号染色体着丝粒探针以原位杂交为主要技术，对52例胸水标本进行研究。结果　在31例肺癌胸水癌细胞中，8号染色体出现超二倍体，4例其他肿瘤患者胸水中肿瘤细胞也出现一定比例的8号染色体超二倍体。细胞学常规检查胸水未找到癌细胞的15例中，有12例8号染色体为二倍体，另3例胸水中出现一定比例的8号染色体超二倍体，其中有2例经复查涂片中找到少数漏诊的腺癌细胞，另1例正在放疗中。2例细胞学诊断为可疑癌的胸水中也发现有8号染色体超二倍体。结论　8号染色体超二倍体对恶性胸水的诊断可能具有重要的参考价值。

Numerical alteration of chromosome 8 in pleural effusions

NING Jing, LIU Shufan, CHENG Shujun.

　　（ Cancer Institue (Hospital), Chinese Academy Medical Science, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China）

　　【Abstract】　Objective　To study the numerical alteration of chromosome 8 and its application for detecting cancer cells in the pleural effusions.Methods　In situ hybridization with chromosome 8 centromere probe was carried out in 52 patients with pleural effusions.Results　In 31 lung cancer patients examined, hyperdiploid chromosome 8 was found in the effusions. The same hyperdiploid of the chromosome was also noted in 4 cases of effusion from adenocarcinoma of breast, mesothelioma and lymphoma. In 15 pleural effusions which were reportedly negative in previous cytological diagnosis, hyperdiploid chromosome 8 was found in 3 cases, and diploid chromosome 8 in another 12 cases by in situ hybridization. After reexemination of the samples from the 3 patients with hyperdiploid chromosome 8, adenocarcinoma cells were found in 2 cases, and the third one was a patient being treated with radiotherapy. Hyperdiploid chromosome 8 also existed in the pleural effusions from 2 cases suspicious of adenocarcinoma.Conclusion　Hyperdiploid chromosome 8 may be a useful marker to ascertain the malignant nature of pleural effusion.

　　【Subject word】　Lung neoplasms; Pleural effusion; In situ hybridization; Aneuploid

　　肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前对肺癌的早期诊断仍然存在着一定的困难，许多患者常常首先发现胸腔积液，而胸腔积液的产生极其复杂。 对胸腔积液中肺癌细胞的细胞遗传学研究表明，肺癌转移至胸水后，在胸水中脱落的癌细胞存在多种克隆性细胞遗传学改变^［1-3］。我们利用8号染色体着丝粒探针，用生物素标记的原位杂交为主要技术，对52例胸水标本的间期细胞进行了研究，探讨对良、恶性胸水的诊断具有辅助作用的指标。

　　材料与方法

　　一、材料

　　1. 标本:患者胸水，由中国医学科学院肿瘤医院临床细胞学室提供，共52例，其中男性31例，女性21例；平均年龄55岁(男性26～79岁，女性28～78岁)。患者分4组：(1) 肺癌合并胸水，共31例(病例1～31)。(2) 其他肿瘤合并胸水，共4例(病例32～35)。(3) 细胞学诊断未发现癌细胞的胸水，共15例(病例36～50)。(4) 细胞学检查可疑癌的胸水，共2例(病例51，52)。

　　2. 质粒和探针: pJM128: 含人8号染色体着丝粒部位特异DNA片段(D8Z2)，ATTC，USA。

　　二、方法

　　1. 胸水原位杂交标本的制备:取胸水离心后收取细胞。加入37℃预温的低渗液(0.075 mol/L KCL)，然后加固定液(3∶1甲醇∶冰乙酸)预固定，离心后弃上清，重复固定2次。悬浮细胞滴在已涂有多聚赖氨酸的载玻片上，自然干燥，用于原位杂交。

　　2. 原位杂交：

　　(1)准备探针：参照本室已报道的方法^［4］提取人8号染色体着丝粒探针DNA，纯化后DNA用BioNick^TM标记系统试剂盒，按说明书上的方法标记探针。乙醇沉淀，干燥后溶于TE，取少部分电泳，峰带在200～400 bp范围内，取微量样品点样于硝酸纤维素膜上，用碱磷酶显色法检测标记强度。

　　(2)杂交：参照吕永杰等^［4］及Dhingra等^［5］的方法，先用70%HAc处理10 min，用含3％H₂O₂的甲醇浸泡3 min，PBS洗3次，脱水，晾干。在含70%去离子甲酰胺的2×SSC中80℃变性4 min，加上述已变性过的DNA探针，封片，置微波炉中半小时，保温半小时，后置湿盒中37℃杂交过夜。

　　(3)ABC法检测：杂交完成后，于44℃含50%甲酰胺的2×SSC中漂洗2次，2×SSC中洗3次，室温下用0.1％ Tween 20的PBS中浸泡3 min。用含3％BSA的PBS封闭，加Avidin,作用5 min，保温5 min，0.1％ Tween 20的PBS 洗3次，加Biotinylated goat anti-avidin antibody 5 μl/ml作用5 min，保温5 min，0.1％Tween 20的PBS 洗3次。加新鲜配制的AB复合物，37℃作用30 min，0.1％ Tween 20的PBS洗4次。DAB显色，苏木素复染，封片后以光镜观察结果。

　　(4)计数细胞的标准:每例每个探针计数200个肿瘤细胞及400个淋巴细胞，以同一标本中的淋巴细胞作为内对照，以其杂交结果作质量控制，＞2个杂交信号的细胞被认为是背景，其所占比例控制在1％以下，凡不满意的标本弃去重做。每一例以双盲法计数2次，取均值。

　　结果与讨论

　　本实验选用52例患者胸水标本，利用8号染色体着丝粒DNA进行间期核生物素标记探针原位杂交。结果在31例肺癌胸水的癌细胞中8号染色体均有部分细胞为超二倍体。本研究8号染色体超二倍体细胞在计数的肿瘤细胞中低者为8％，高的可达100％，与对应的淋巴细胞间差异均有显著性(P＜0.01)，而非肿瘤细胞(淋巴细胞)中8号染色体为二倍体，超二倍体比例极低(＜1%)。

　　在病例1～31肺癌患者中，有18例除细胞学结果外尚有影像学或电镜、病理学诊断，即有两项以上指标。而另13例只有细胞学诊断。在这两组中，超二倍体＜20%各有3例，在20%～30%之间的分别为3例和0例。这两组之间8号染色体超二倍体细胞分布比例是相似的，差异无显著性(P＞0.05)。本研究结果表明：细胞学诊断是可信的，有无细胞学以外的诊断依据，对8号染色体超二倍体细胞分布比例的判断无明显影响。

　　在对4例其他肿瘤患者胸水的检测中发现,癌细胞中8号染色体超二倍体的细胞明显升高(病例32占37％，病例33占60％，病例34占23％，病例35占66％)，提示我们考虑选择8号染色体作为一种恶性胸水辅助诊断的指标之一。

　　以8号染色体着丝粒探针对15例常规细胞学未查到癌细胞的胸水标本进行原位杂交，分别计数200个非淋巴细胞和400个淋巴细胞，发现其中12例的非淋巴细胞基本为二倍体范围，而超二倍体细胞数目极低(＜1％)，与淋巴细胞无差别(P＞0.05)；另3例为不相符的病例。病例36和病例42临床诊断为肺癌，细胞学诊断为间皮细胞增生。但本研究发现其8号染色体＞2个杂交信号的细胞分别占11.4%和40.0%，与对应淋巴细胞相比，差异有显著性(P＜0.01)，后复查存档涂片寻找到腺癌细胞。病例45发现8号染色体＞2个杂交信号的细胞分别为8.5%和9.0%，两者差异无显著性(P＞0.05),后复查病案,发现该患者正在接受放射治疗,放疗第13天取胸水,此种现象可能为放疗引起正常细胞染色体损伤的结果^［6］, 放疗可能引起染色体着丝粒部位的断裂，或形成双等臂双着丝粒染色体。

　　以8号染色体着丝粒探针对2例细胞学诊断为可疑癌的胸水标本进行原位杂交，病例51和病例52非淋巴细胞中＞2个杂交信号的细胞分别占67.0%和20.5%，这两例经CT检查提示为肺癌。

　　综上所述，我们认为胸水中8号染色体数目增多是一种非常常见的遗传学变化，而未查到癌细胞的胸水中未发现有这种改变(除外放疗及化疗的损伤)。因此，对于细胞学难以确诊为癌性胸水的病例, 8号染色体超二倍体可做为一种辅助诊断方法。

　　参考文献：

　　［1］　Lukeis R, Ball D, Irving L, et al. Chromosome abnormalities in non-small cell lung cancer. Genes Chrom Cancer, 1993, 8: 262-296.

　　［2］　Viegas-Pequignot E, Flury-Herard A, DE Cremonx H, et al. Recurrent chromosome aberration in human lung squamous cell carcinomas. Cancer Genet Cytogenet, 1990, 49: 37-49.

　　［3］　Wang-Peng J, Knutsen T, GazdarA, et al. Nonrandom structural and numerical chromosome changes in non-small-cell lung cancer. Genes Chrom Cancer, 1990, 3:168-188.

　　［4］　Lu YJ, Cheng SJ, Ning J,et al. An accelerated in situ hybridization procedure using microwave irradiation. Chrom Res, 1997,5: 147-149.

　　［5］　Dhingra K, Sneige N, Pandita TK, et al. Quantitative analysis of chromsome in situ hybridization singal in paraffin-embedded tissue sections. Cytometry, 1994, 16:100-112.

　　［6］　Fantes JA, Green DK, Hill W, et al. Apllication of automation to the detection of radiation damage using FISH technology. Int J Radiat Biol,1995, 68: 263-278.

收稿日期：1999-03-03