原位分子杂交检测肺癌组织MRP基因表达及意义

中华肿瘤杂志 2000年第1期第22卷 临床研究

作者：单根法　钟竑　张辅贤　李国庆　隆桂麟　顾鹤定　戚晓敏

单位：单根法（上海第二医科大学附属新华医院成人心胸外科，200092）；钟竑（上海第二医科大学附属新华医院成人心胸外科，200092）；张辅贤（上海第二医科大学附属新华医院成人心胸外科，200092）；李国庆（上海第二医科大学附属新华医院成人心胸外科，200092）；隆桂麟（上海第二医科大学附属新华医院成人心胸外科，200092）；顾鹤定（上海第二医科大学附属新华医院成人心胸外科，200092）；戚晓敏（上海第二医科大学附属新华医院成人心胸外科，200092）

　　关键词： 肺肿瘤；多药耐药性；MRP基因；预后

　　【摘要】　目的　研究多药耐药性相关蛋白基因-MRP基因(multi-drug resistance associated protein gene, MRP gene)对肺癌患者预后的影响。方法　应用地高辛抗体标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术，检测47例非小细胞肺癌(NSCLC)根治术后石蜡组织标本中肺癌细胞MRP基因mRNA表达，并回顾性随访。结果　47例组织标本中，肺癌细胞均有不同程度MRP基因mRNA过度表达，其表达水平与患者术后生存期、化疗疗效、复发及转移密切相关，与病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、癌细胞分化程度、年龄、性别无明显相关性。结论　MRP基因与肺癌患者预后有密切相关性，检测MRP基因mRNA表达水平可作为预测肺癌患者预后、确定化疗方案的手段之一。

Expression and prognostic significance of multidrug resistance associated protein (MRP) gene in non-small cell lung cancer by in situ hybridization

SHAN Genfa, ZHONG Hong, ZHANG Fuxian, et al.

　　（Department of Thoracic Surgery, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092, China）

　　【Abstract】　Objective　To study the effect of MRP gene overexpression on prognosis of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods　Paraffin-embedded tissues from 47 cases of NSCLC who had under-gone radical tumor resection were examined for expression of MRP gene mRNA by in situ hybridization using labelled digoxigenin probes combined with immunohistochemistry. All the patients were retrospectively followed-up.Results　All of the 47 lung cancer specimens were found to have overexpression of MRP mRNA. It was significantly correlated with patients′ survival period, response to chemotherapy, recurrence and mestastases after surgery, but was not correlated with histology, tumor size, node status, TNM stage, degree of differentiation, age and sex.Conclusion　Overexpression of MRP gene is a marker of prognostic significance in patients with NSCLC.

　　【Subject words】　Lung neoplasms; Multi-drug resistance; MRP gene; Prognosis

　　肿瘤耐药性形成机制及逆转已成为肿瘤分子生物学研究热点^［1］。我们应用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术，检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者石蜡组织标本中肺癌细胞MRP基因mRNA表达水平，并回顾性随访，研究MRP基因表达与肺癌患者临床病理诸要素、术后生存期、化疗疗效、复发及转移的相关性，以期应用MRP基因作为临床预测肺癌患者预后、确定化疗方案的手段之一。

　　材料与方法

　　1.临床资料：收集完整、可靠的NSCLC患者病史资料，病理石蜡标本47例，其中男性35例，女性12例。年龄分布：＜55岁13例，55～65岁20例，＞65岁14例。病理类型：鳞状细胞癌24例，腺癌23例。病理分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期5例，Ⅲa期9例，Ⅲb期6例。分化程度：高分化11例，中分化21例，低分化15例。本组有35例患者术后接受常规化疗。

　　2.探针制备：检测MRP基因mRNA表达的反意寡核苷酸探针依据Thomas等^［2］所报道的序列，由中国科学院上海生物工程中心合成，序列长度为30个核苷酸。探针A-CAAGCTGGCGCTGCCCGACACTGA-GGTTCT标记3′末端，探针B-CAGACAGGTTCACGCC-CTTCTCGCCAATCT标记5′末端。

　　3.标记探针：按Boehringer Mannheim公司所提供试剂盒及方法，应用地高辛抗体标记探针。

　　4.组织切片：病理学常规方法石蜡切片取自肺癌组织及癌周正常组织用于实验。

　　5.原位分子杂交及免疫组织化学方法按参考文献［2］进行，病理学用HE染色复染。

　　6.显微镜观察及统计学分析：光学显微镜下可观察到MRP基因阳性细胞内有浅蓝色颗粒。计数肺癌细胞，得出阳性细胞百分率。计算机辅助扫描，得出阳性颗粒占细胞面积的百分比(%)，并用计算机SAS系统进行统计学分析。

　　结果

　　1.MRP基因mRNA表达水平与肺癌患者临床病理诸要素的相关性：统计学分析显示，肺癌细胞MRP基因mRNA表达水平明显高于癌周正常肺组织(P＜0.01)，表明肺癌细胞均有不同程度的MRP基因mRNA过度表达；但其过度表达及表达程度与肺癌患者病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分期、分化程度、年龄、性别无明显相关性(P＞0.05)。这一结果与白莉等^［3］所报道肺癌mdrl基因表达与肺癌多药耐药性研究相似。

　　2.MRP基因mRNA表达水平与肺癌患者术后生存期的相关性：由表1可见，肺癌细胞MRP基因mRNA过度表达水平与肺癌患者术后生存期有明显相关性，生存＜1，＜2，＜3，＞3年比较，P＜0.01或P＜0.05，MRP基因mRNA表达水平越高，患者生存期越短。同时，统计结果显示，5′末端检测效果高于3′末端检测。

表1　MRP基因mRNA表达与肺癌患者生存期的相关性

生存期(年)	例数	探针	±s(%)*
＜1	11	寡核苷酸3′末端	2.54±0.24
		寡核苷酸5′末端	3.03±0.26
＜2	14	寡核苷酸3′末端	2.07±0.12
		寡核苷酸5′末端	2.80±0.27
＜3	9	寡核苷酸3′末端	1.83±0.14
		寡核苷酸5′末端	1.99±0.10
＞3	13	寡核苷酸3′末端	1.54±0.18
		寡核苷酸5′末端	1.66±0.19

　　^* MRP基因mRNA表达水平-阳性颗粒占细胞面积的百分比(%)

　　3.MRP基因mRNA表达水平对化疗疗效的影响：由表2可见，MRP基因mRNA的过度表达严重影响肺癌患者术后化疗疗效，术后化疗患者生存期＜1，＜2，＜3，＞3年比较，差异有显著性(P＜0.01或P＜0.05)，MRP基因mRNA高表达者化疗疗效差。

　　4.MRP基因mRNA表达与肺癌患者术后复发或转移的关系：由表3可见，术后1年内复发或转移患者的肺癌细胞MRP基因mRNA表达明显高于3年内未见复发或转移患者(P＜0.01)。

表2　MRP基因mRNA表达水平与化疗疗效的相关性

生存期(年)	例数	探针	±s(%)*
＜1	8	寡核苷酸3′末端	2.54±0.27
		寡核苷酸5′末端	3.30±0.24
＜2	8	寡核苷酸3′末端	2.09±0.13
		寡核苷酸5′末端	2.75±0.31
＜3	8	寡核苷酸3′末端	1.83±0.14
		寡核苷酸5′末端	1.98±0.10
＞3	11	寡核苷酸3′末端	1.52±0.18
		寡核苷酸5′末端	1.64±0.18

　　^* MRP基因mRNA表达水平-阳性颗粒占细胞面积的百分比(%)

表3　MRP基因mRNA表达与肺癌患者术后复发或

　　转移的关系

复发或转移(年)	例数	探针	±s(%)*
＜1	12	寡核苷酸3′末端	2.36±0.33
		寡核苷酸5′末端	3.05±0.45
＞3	11	寡核苷酸3′末端	1.55±0.23
		寡核苷酸5′末端	1.90±0.41

　　^* MRP基因mRNA表达水平-阳性颗粒占细胞面积的百分比(%)讨论

　　MRP基因是Cole等^［4］对抗癌药物诱导产生耐药性的肺癌细胞株中研究发现，位于人类染色体16P13.1，编码跨膜糖蛋白泵分子Pgp-190，可将疏水性化疗药物逆浓度差泵出细胞外，减少细胞内药物蓄积，从而导致细胞产生耐药性。Sorensen等^［5］发现原发性肺癌患者手术标本中的肺癌细胞同样有不同程度MRP基因表达，该基因可在化疗药物的诱导下激活、扩增进而产生耐药性。我们所检测的47例NSCLC患者手术标本亦显示，肺癌细胞中有不同程度的MRP基因mRNA表达，其表达水平与患者术后化疗疗效有直接的关联。Berger等^［6］曾应用RT-PCR方法对15株未经抗癌药物刺激培养的肺癌细胞株及正常肺组织细胞进行肺癌细胞耐药性研究，发现此类未经抗癌药物刺激培养的肺癌细胞中，有不同程度的MRP基因表达，其中两株肺癌细胞的MRP基因表达水平，甚至高于经抗癌药物刺激培养产生耐药性的肺癌细胞株；该研究同时显示，MRP基因在抗癌前体药物的转运中起着关键性的作用。我们用两条合成的不同的寡核苷酸链，分别检测肺癌细胞MRP基因mRNA3′，5′末端，研究结果显示，5′末端检测效果优于3′末端。

　　近年来在其他实体瘤的研究中表明，MRP基因表达不仅影响肿瘤患者的化疗疗效，更可影响肿瘤患者生存期。Murray等^［7］的研究即显示，神经母细胞瘤患者MRP基因表达与化疗疗效、患者生存期具有显著相关性。我们的研究结果显示，肺癌患者MRP基因mRNA过度表达影响患者术后生存期和复发及转移，而与患者的临床病理诸要素无明显相关性。

　　我们在研究中采用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术检测石蜡肺癌组织标本，该方法经HE染色可在直视条件下从成分复杂的肺组织切片中对肺癌细胞MRP基因mRNA表达进行直观分析，同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序也有极高的敏感性，并可完整地保存组织与细胞的形态，因而具有确切的可靠性及科学性。本研究结果表明，应用地高辛标记探针原位分子杂交结合免疫组化技术方法适合于临床实际。同时，检测肺癌组织MRP基因mRNA表达水平可作为预测肺癌患者预后、确定化疗方案的手段之一。

　　基金项目：上海市自然科学基金项目(96ZB14043)

　　参考文献：

　　［1］　钟竑.肺癌细胞耐药机制研究进展(综述).国外医学呼吸系统分册，1996，16(增刊)：27-30.

　　［2］　Thomas GA, Barrand MA, Stewart S, et al. Expression of the multidrug resistance-asociated protein (MRP) gene in human lung tumors and normal tissue as determined by in situ hybridisation. Eur J Cancer, 1994,30A：1705-1709.

　　［3］　白莉，孙燕，李申德.mdrl基因的表达和肺癌多药耐药的关系.中华结核和呼吸杂志，1997，20：30-32.

　　［4］　Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH, et al. Overexpression of a transporter gene in a multidrug resistence human lung cancer cell line. Science, 1992,258：1650-1654.

　　［5］　Sorensen KM, Jensen PB, Nielsen BS, et al. Immunohistochemical detection of DNA topoisomerase Ⅱa, p-glycoprotein and multidrug resistance protein (MRP) in small-cell and non-small-cell lung cancer. Br J Cancer, 1998,77：1469-1473.

　　［6］　Berger W, Elbling L, Hauptmann E, et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) and chemoresistance of the human non-small-cell lung cancer cells. Int J Cancer, 1997,73：84-93.

　　［7］　Murray DN, Boraow SB, Marshall GM, et al. Expression of the gene for multidrug-resistance-associated protein and outcome in patients with neuroblastoma. N Engl J Med, 1996,334：231-238.

收稿日期：1999-03-18