非小细胞肺癌患者肿瘤浸润性淋巴细胞中T细胞克隆性增殖
肿瘤 2000年第6期第20卷 基础研究
作者：杨学宁 吴一龙 李锦添 王思愚 周昕熙
单位：杨学宁 吴一龙 李锦添 王思愚 周昕熙（中山医科大学肺癌研究中心 中山医科大学肿瘤防治中心胸科 广州510060）
关键词：肺肿瘤；T细胞受体β；T淋巴细胞亚群；细胞，培养的
摘要：目的 分析非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)病人肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的T细胞受体(TCR)Vβ24个亚家族基因的克隆性增殖及分布情况。方法 肺腺癌病人1例，术中取新鲜肺癌组织，肺癌组织经处理后分别与自身肿瘤细胞共同培养3.5天和7天。10例健康人、T细胞株Jurkat和B细胞株Raji作为对照。标本共16份，提取mRNA后经反转录多聚酶链反应(RT-PCR)，PCR产物进一步经基因扫描分析Vβ24个亚家族基因的互补决定区3(CDR3)以确定T细胞克隆性。结果 NSCLC病人外周血T细胞仅表达16个Vβ亚家族，Vβ6和Vβ17呈寡克隆。新鲜肺癌组织TIL仅检测到Vβ19表达，呈寡克隆；培养7天后，检测7个Vβ亚家族表达，Vβ8和Vβ16呈寡克隆。10例正常人T细胞表达所有24个Vβ亚家族且均呈多克隆性分布。结论 NSCLC病人TIL中，TCR Vβ24个亚家族存在倾斜性分布，T细胞存在克隆性增殖。这可能是肿瘤相关抗原(tumor associated antigens,TAA)刺激引起的特异性T细胞免疫反应。研究结果提示，构成经培养的TIL的主要T细胞成分是克隆性增殖的表达有限几个TCR Vβ亚家族的T细胞，这些克隆性增殖T细胞可能是TIL对自身肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的效应细胞。
中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0396-05
THE FEATURE OF CLONAL EXPANSION AND DISTRIBUTION OF TCR Vβ T CELLS OF CULTURED NSCLC TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTES
YANG Xue-ning WU Yi-long LI Jin-tian
Lung Cancer Research Center,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou,510060,China
Abstract：Objective To study the distribution of TCRVβ subfamilies and clonal expansion of peripheral blood lymphocytes (PBL) and tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients.Methods Fresh NSCLC tumor samples were collected soon after the resection, and the TILs were cultured for 0,3.5,7 days respectively. PBL collected before operation. The complementarity determine region 3 (CDR3) of 24 TCRVβ subfamilies genes were amplified by RT-PCR, the PCR products were further analyzed by Genescan to identify the clonality of the T cells.Results PBL expressed 16 TCRVβ subfamilies, Vβ6 and Vβ17 were oligoclonal. Fresh TIL expressed 1 TCRVβ subfamily, Vβ19 was oligoclonal. TIL cultured 3.5 days expressed 5 TCRVβ subfamilies, Vβ5 was biclonal, Vβ16 was oligoclonal. TIL cultured 7 days expressed 7 TCRVβ subfamilies, Vβ8 and Vβ16 were oligoclonal. All 24 TCRVβ subfamilies were expressed and polyclonal in normal control.Conclusion The skew distribution and clonal expansion of TCRVβ subfamily T cells were detected in PBL and cultured NSCLC TILs. It may be the T cell clones for specific immune response due to tumor-associated-antigens(TAA). The present result showed that the cultured TIL mainly consists of a few TCRVβ subfamily clonal expanded T cell subsets. It suggests that these clonal expansion T cells are potentially specific cytotoxic to autologous tumor cells.
Key words： Lung neoplasms; T cell receptor β； T lymphocyte subsets; cells,cultured
在实体瘤中，常有大量淋巴细胞浸润原发肿瘤部位。这些聚集于肿瘤部位的肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)的数量与病人的预后有明显的关系，浸润程度愈高预后愈好，可作为预后指标［1］。TIL被认为代表了机体对肿瘤的特异性免疫反应。研究表明，TIL中存在克隆性增殖T细胞［2—5］，这可能是机体针对肿瘤相关抗原(tumor associated antigens, TAA)的一种反应。利用T细胞受体(T cell receptor,TCR)基因重排时其互补决定区3(Complementarity dertermining region, CDR3)的高度多样性和Vβ基因24个亚家族的特点，应用反转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和基因扫描分析(genescan)的方法检测T细胞Vβ亚家族分布及其克隆性(clonality)是近年国外新开展的研究肿瘤免疫的方法［6］。本研究利用该方法分析1例非小细胞肺癌(NSCLC)病人外周血和与自身肿瘤细胞共同培养的TIL中TCRVβ T细胞的分布及其克隆性。
材料与方法
一、标本 标本共16份：经病理证实的NSCLC病人1例，病理学分型为腺癌。术前取病人外周血10 ml，手术切除肺叶后立即取新鲜肺癌组织。10例健康人外周血为正常对照，T细胞株Jurkat作为单克隆对照，B细胞株Raji为阴性对照。
二、肺癌组织TIL的培养 取0.1g肺癌组织剪成细小组织块后，加入10 ml完全RPMI-1640培养体系中培养，其中含IL-2 500 U/ml，10 %小牛血清，青、链霉素各200 U/ml，于5 % CO2 37 ℃，饱和湿度中分别培养3.5天和7天。
三、RNA提取和反转录合成cDNA 外周血单个核细胞分离按常规方法进行。新鲜肺癌组织经研磨后行RNA提取。经培养的TIL收集后即可用于RNA提取。RNA提取应用RNAzol试剂盒(Gibco,BRL)并应用随机引物和反转录酶试剂盒(Superscript Ⅱ, Gibco,BRL)反转录合成cDNA第一链，均按常规方法进行。
四、反转录-多聚酶链反应(RT-PCR) 据已报道的24个Vβ亚家族基因分别设计上游引物Vβ1-Vβ24 24个Vβ引物，在Cβ区设下游引物一个［3］。引物的核苷酸序列见吴一龙等［2］报道。在Cβ引物内侧设一荧光素标记的Cβ-Fam引物(5′-Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG)［3］，作为基因扫描分析之用。引物均由德国柏林TIB MOLBIOL公司合成。PCR操作按已报道的方法进行［3］，作为基因扫描分析之用。引物均由德国柏林TIB MOLBIOL公司合成。PCR操作按已报道的方法进行［3］。总体积为25 μl，其中含1 μl cDNA，0.1 mmol/L dNTP(dATP,dCTP,dGTP和dTTP)，引物浓度为0.5 μmol/L(任一Vβ引物和Cβ引物)，125U Taq聚合酶，反应在PCR缓冲液中进和［10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3, 5 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2及0.001%(W/V)明胶］，所有试剂均为Perkin Elmer公司产品。反应共进行40循环，变性温度为94 ℃，1 min(末次10 min)。结束后于4 ℃保存。各反应均设阳性和阴性对照。PCR产物于2.5 %琼脂糖(溴化乙锭染色)凝胶中分析结果。
五、T细胞克隆性分析(CDR3长度分析)
1.标记PCR产物(run off reaction)
RT-PCR产物经电泳分析出现阳性带者进一步经荧光素标记的下游引物Cβ-Fam进行不对称PCR扩增，以得到荧光素标记的单链PCR产物［3］。反应体系总体积为10 μl，含2 μl未标记PCR产物，0.1 μmol/L Cβ-Fam，3 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.25 U Taq聚合酶，共进行35循环，退火温度为66 ℃，余同上［3］。
2.基因扫描(Genescan)分析(CDR3长度分析)及结果判定
取荧光素Fam标记的PCR产物1 μl，加入2.5 μl甲酰胺、0.5 μl(Genescan-500-Tamra分子量标准品(ABI，Perkin Elmer公司)和0.5 μl加样缓冲液(Genescan-500-Tamra试剂盒，含葡聚糖蓝50 mg/ml，EDTA 25 mmol/L)，于94 ℃变性4 min后于6 %聚丙酰胺凝胶，自动序列分析仪ABI 377 DNA序列分析仪(ABI，Perkin Elmer公司)中电泳，收集资料。具体操作步骤按使用指南进行。通过分析仪中的基因扫描分析软件672对计算机收集的结果进行分析。据电泳过程中不同时间所出现的不同强度、不同颜色的荧光素，相应地显示出不同位置、高度、颜色和形状的峰。峰的位置表示产物的大小(与标准品比较可知确切的碱基对数)，峰的高度表示产物的量，峰的形态表示产物的均一性。如果产物中所含的DNA片段大小完全相同，基因扫描分析显示为单一峰；如果绝大多数DNA片段大小相同，则显示为一主峰及个别极低的小峰；如果产物中DNA片段参差不齐，则呈多峰图像；三者分别提示PCR产物来自单克隆(monoclonal)、寡克隆(oligoclonal)和多克隆(polyclonal)的T细胞［2］。
结 果
一、TCR Vβ亚家族T细胞的表达情况 10例正常人外周血单个核细胞表达所有24个Vβ亚家族。NSCLC病人外周血T细胞表达16个Vβ亚家族。未经培养的新鲜肺癌TIL仅表达Vβ19亚家族；与自身肿瘤细胞共同培养3.5天的TIL表达5个Vβ亚家族；培养7天的TIL表达7个Vβ亚家族。单克隆对照T细胞株Jurkat仅表达Vβ8。阴性对照B细胞株Raji则不表达任何Vβ亚家族(见表1)。
二、T细胞克隆性分析结果 对发现阳性带的产物均进行基因扫描分析。结果：NSCLC病人外周血中Vβ6和Vβ17亚家族PCR产物呈一主峰图象(寡克隆)，提示产物大小绝大部分相同，即绝大多数的CDR3长度相同，其余表达的Vβ亚家族均呈多峰图象(多克隆)(见图1)；未经培养的新鲜肺癌TIL中Vβ19呈寡克隆(见图2)；与自身肿瘤细胞共同培养3.5天的TIL中，Vβ5呈双峰图象(双克隆)，Vβ16呈寡克隆，余呈多克隆(见图3)；培养7天的TIL中，Vβ14呈双克隆，Vβ8和Vβ16呈寡克隆，余呈多克隆(见图4)；T细胞株Jarkat Vβ8 PCR产物呈单峰图象(单克隆)；10例正常人全部PCR产物均呈多克隆。
表1 1例肺腺癌病人的外周血、新鲜肺癌TIL和经培养肺癌TIL的TCRVβ亚家族T细胞克隆性
| 引物 |
PBL |
fresh
TIL |
cultured TIL
(3.5 d) |
cultured TIL
(7 d) |
| Vβ1 |
Poly |
|
Poly |
| Vβ2 |
Poly |
| Vβ3 |
Poly |
| Vβ5 |
Poly |
|
Bi |
Poly |
| Vβ6 |
Oligo |
|
|
Poly |
| Vβ7 |
Poly |
|
Poly |
Poly |
| Vβ8 |
Poly |
|
|
Oligo |
| Vβ14 |
|
|
|
Bi |
| Vβ15 |
Poly |
| Vβ16 |
Poly |
|
Oligo |
Oligo |
| Vβ17 |
Oligo |
| Vβ18 |
Poly |
| Vβ19 |
Poly |
Oligo |
| Vβ20 |
Poly |
| Vβ21 |
Poly |
| Vβ22 |
Poly |
| Vβ23 |
Poly |
|
Poly |
Poly |
PBL：外周血淋巴细胞；Bi：双克隆；Oligo：寡克隆；Poly：多克隆
图1 肺癌病人外周血淋巴细胞基因扫描分析结果
图2 新鲜肺癌TIL基因扫描分析结果
图3 肺癌TIL(培养3.5d)基因扫描分析结果
图4 肺癌TIL(培养7d)基因扫描分析结果
讨 论
TCR是T细胞识别和结合抗原、参与特异性细胞免疫的重要分子。在T细胞发育过程中，胚系的TCR各基因片段(VD和J片段)发生重排。重排时，在V-D、D-J之间可有不同数量及不同序列的核苷酸随机插入，称为N区，故形成了具有高度多样性的可变区，即VNDNJ区，即CDR3区［7］。这种高度多样性是机体特异性识别抗原所需的。来自同一克隆的T细胞，其TCR的CDR3区的长度和序列完全相同，反之亦然。采用荧光素标记PCR产物后进行基因扫描分析的方法检测TCR Vβ24亚家族CDR3长度的差别来确定T细胞的克隆性，是国外近年新的研究肿瘤免疫的方法。
本研究在NSCLC病人外周血以及TIL中，TCR Vβ24个亚家族的表达存在倾斜性分布。外周血仅表达16个Vβ亚家族(与之相比，正常人外周血则表达所有24个亚家族)，而新鲜TIL仅检测到1个Vβ亚家族表达，经培养7天的TIL也仅表达7个Vβ亚家族。这种现象可能与病人存在某些特异性抗原(如肺癌TAA)等所引起的刺激有关，且可能越靠近肿瘤部位，抗原刺激也越强，其TCR Vβ亚家族选择性表达的倾向性就越强；另一方面，某些Vβ亚家族T细胞减少，可能与肺癌病人部分细胞免疫功能缺陷有关［2，3］。进一步基因扫描分析发现，病人外周血和经培养的TIL中存在1～3个克隆性增殖的TCR Vβ亚家族。已在多种实体瘤的TIL和外周血中发现这种现象［2，8，9］。Gold［7］认为这是因为TIL选择性地使用一个或几个TCRV基因片段来应答肿瘤部位长期的抗原性刺激，从而导致克隆性T细胞免疫反应并在肿瘤部位聚集。这些研究提示在肿瘤部位甚至外周血中，T细胞Vβ基因克隆性表达与直接参与识别自身肿瘤细胞相关的抗原有关。但TCRVβ基因的使用具有多样性［10］。外周血与TIL中克隆性T细胞不同的原因可能与肿瘤抗原存在不同的表位，或同一肿瘤存在一种以上的抗原有关。
有研究显示，从肿瘤部位获得的新鲜TIL可能还存在某些抑制因子，抑制TIL的生长［11］。故新鲜分离的TIL抗自身肿瘤活性低，数量少。本研究在新鲜的TIL中仅能检测到两个TCRVβ亚家族表达。推测可能是因为新鲜分离的TIL数量太少，以本检测方法的灵敏度不足以检出。TIL在自身肿瘤抗原、低浓度的IL-2存在的条件下可大量扩增，并保持高活性的抗自身肿瘤细胞的能力。临床应用此方法在体外培养扩增的TIL用于过继免疫细胞治疗(adoptive immunotherapy,ATL)。本研究TIL与自身肿瘤细胞在低浓度IL-2存在的条件下共同培养后，则可检测到多个TCRVβ亚家族克隆性增殖。
TIL对自身肿瘤细胞具有强大的细胞毒作用，而对异体同类肿瘤的杀伤力有限，对自身正常细胞则无杀伤作用。经培养扩增的TIL 80%以上为成熟T淋巴细胞，抗瘤活性较LAK细胞强50～100倍［12］。构成经培养的TIL的主要T细胞成分是克隆性增殖的表达有限几个TCRVβ亚家族的T细胞，这些克隆性增殖T细胞可能是TIL对自身肿瘤细胞具有特异性杀伤作用的效应细胞。但仍需进一步的研究。
Maccalli等［12］证实来源于肿瘤部位TIL的表达某些TCRVβ的克隆性增殖T细胞具有MHC-Ⅰ类分子限制性自身肿瘤细胞杀伤作用。最近Semino等［13］将6例晚期NSCLC病人外周血与自身肿瘤细胞混合培养，找到两个CD8+的克隆(TCRVβ3和TCRVβ7)，它们对自身肿瘤细胞具有MHC-Ⅰ类分子限制性杀伤作用。通过对NSCLC病人体内存在的这些克隆性T细胞的特异性杀伤作用的研究，有助于明确TIL中各T细胞亚群的功能并分离出对自身肿瘤细胞具有特异杀伤作用的效应细胞［6］。
基金项目：卫生部科学研究基金(98-2-377)，广东省科委攻关项目(99M04903G)资助
杨学宁，男，在读医学博士，住院医师。
参考文献
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(收稿日期：2000-07-17)
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