肺癌组织中P¹⁶蛋白与血管内皮生长因子表达的临床意义

山东医药 2000年第19期第40卷 论著

作者：崔言刚　王英年　张可佳　朱为群

单位：青岛医学院第二附属医院　山东青岛266042

关键词：肺癌　P¹⁶蛋白　血管内皮生长因子　免疫组化

　　摘要　采用SABC免疫组织化学方法检测了71例肺癌患者（肺癌组）癌组织中P¹⁶蛋白和血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况，并与20例肺良性病变患者（对照组）比较。结果肺癌组的P¹⁶蛋白阳性率为53.52％，明显低于对照组（90％），P＜0.01；有淋巴结转移者的P¹⁶蛋白阳性率显著低于无淋巴结转移者；肺癌分期为Ⅲ～Ⅳ期者P¹⁶蛋白阳性率显著低于Ⅰ～Ⅱ期者。肺癌组VEGF阳性率为71.83％，明显高于对照组（20％），P＜0.01；吸烟量少者VEGF阳性率显著高于吸烟量多者，肿瘤低分化者显著高于高分化者，有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者，肺癌为Ⅲ～Ⅳ期者显著高于Ⅰ～Ⅱ期者。证实肺癌中P¹⁶蛋白与VEGF呈负相关；P¹⁶蛋白及VEGF表达均为判断肺癌预后的指标。

　　中图分类号：R734.2　　文献标识码：A

　　Abstract The expression of P¹⁶ protein and vascular endothelial growth factor（VEGF）in specimens from 71 patients with lung carcinoma and 20 patients with lung benign disease（Control group）were measured by SABC immunohistochemistry stain method.The positive rate of P¹⁶ protein in lung carcinoma was significantly lower than that in control group（53.52％ versus 90.00％，P＜0.01）.The positive rate of P¹⁶ protein was lower in patient with lymph node metastasis than that in those without lymph node metastasis，and lower in stage Ⅲ～Ⅳ group than in stage Ⅰ～Ⅱ group.The positive rate of VEGF in patients with lung carcinoma was significantly higher than that in control group（71.83％ versus 20％，P＜0.01）.The positive rate of VEGF was higher in less smoking group than that in more smoking group，and lower in low differentiation group than in high differentiation group，and in lymph node metastasis group than in lymph nonmetastasis group，and in stage Ⅲ～Ⅳ group than in stage Ⅰ～Ⅱ group.There was a significantly negative relation between the expression P¹⁶ and VEGF in lung carcinoma.The expression of P¹⁶ protein and VEGF may be good prognostic indicator for patients with lung carcinoma.

　　Key words Lung carcinoma P¹⁶ protein Vascular endothelial growth factor Immunohistochemitry stain

　　肿瘤的形成及发展可分为两个阶段，即肿瘤细胞的克隆性增殖阶段及血管形成、肿瘤持续生长阶段。P¹⁶基因是一种抑癌基因，其基因产物为P¹⁶蛋白，对细胞生长起负调节作用。P¹⁶蛋白的丧失可使细胞周期蛋白依赖性激酶CDK₄活化，导致Rb蛋白持续磷酸化及细胞无限制增殖^〔1〕。VEGF是一高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，是迄今发现的重要的肿瘤血管生成因子之一^〔2〕。目前，P¹⁶蛋白与VEGF的相关性研究报道极少。1986年6月至1996年6月，　我们采用免疫组织化学方法观察了71例肺癌患者癌组织中P¹⁶蛋白和VEGF的表达情况，旨在探讨两者的相关性及阳性表达的临床意义。

　　1　资料与方法

　　1.1　　一般资料　随机收集于我院胸外科行手术切除的71例肺癌患者的癌组织标本（肺癌组）。患者年龄30～71岁，平均56.5岁；其中男39例，女32例。组织分型为鳞癌30例，腺癌28例，小细胞肺癌13例。按国际抗癌联盟（UICC）1997年制定的TNM分期标准^〔3〕，Ⅰ期9例，Ⅱ期25例，Ⅲ期33例，Ⅳ期4例。对照组为20例肺部良性疾病（炎症、肺结核、肺大疱、支气管扩张）患者的手术标本。

　　1.2　方法　兔抗人P¹⁶多克隆抗体及兔抗人VEGF多克隆抗体系Santa　Cruz公司产品，SABC试剂盒及DAB均购自北京中心生物技术有限公司。采用SABC免疫组化检测技术检测P¹⁶蛋白及VEGF。以PBS替代一抗作为阴性对照，以已知肺癌阳性切片作为阳性对照，普通光学显微镜检测染色切片，P¹⁶、VEGF阳性标准为细胞浆或核膜存在棕黄色颗粒。由2名病理医师双盲观察至少5个具有代表性的高倍视野，并计算染色阳性细胞数目，平均每视野阳性细胞数百分率大于10％为阳性表达（＋），小于或等于10％为阴性表达（－）。用χ²检验进行统计学处理。

　　2　结　果

　　2.1　两组P¹⁶蛋白和VEGF的表达情况　P¹⁶蛋白阳性者组织细胞棕黄色颗粒定位于胞浆，部分核膜也有表达。肺癌组P¹⁶蛋白阳性率为53.52％，对照组为90％，差异有显著性（P＜0.01）。VEGF阳性者棕黄色颗粒定位于胞浆。肺癌组VEGF阳性率为71.83％，对照组为20％，二者差异有高度显著性（P＜0.001）。

　　2.2　P¹⁶蛋白表达与肺癌临床、病理因素之间的关系　见表1。由表1可见，肺癌P¹⁶蛋白表达与性别、年龄、吸烟情况、肿瘤大小、组织类型及分化程度均无关（P＞0.05）。无淋巴结转移者P¹⁶蛋白阳性率高于有淋巴结转移者，差异有显著性（P＜0.01）；肺癌为Ⅰ～Ⅱ期者P¹⁶蛋白阳性率高于Ⅲ～Ⅳ期者，差异有显著性（P＜0.01）。

　　2.3　VEGF表达与肺癌临床、病理因素之间的关系　见表1。由表1可见，VEGF表达与肺癌患者的性别、年龄、肿瘤大小及组织类型均无关（P＞0.05）。吸烟量少者VEGF阳性率高于吸烟量多者，差异有显著性（P＜0.05）；低分化肺癌VEGF阳性率高于高分化肺癌，差异有显著性（P＜0.05）；有淋巴结转移者VEGF阳性率高于无淋巴结转移者，差异有显著性（P＜0.01）；肺癌为Ⅰ～Ⅱ期者VEGF阳性率低于Ⅲ～Ⅳ期者，差异有显著性（P＜0.01）。

　　2.4　肺癌患者P₁₆蛋白与VEGF表达的相关性　见表2、3。由表2可见，肺癌组P¹⁶（－）、VEGF（＋）者占42.25％，对照组为10％，有显著差异（P＜0.01）；肺癌组P¹⁶（＋）、VEGF（－）者占23.94％，对照组为70％，差异有显著性（P＜0.01）。从表3可见，肺癌组P¹⁶蛋白与VEGF表达有相关性，结合表2结果可知，P¹⁶蛋白上调则VEGF下调，P¹⁶蛋白下调则VEGF上调，两者呈负相关关系。

　　3　讨　论

　　细胞周期调控的分子机制涉及细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）及CDKs抑制蛋白三种分子间的相互作用，其核心是CDKs的活性及调控。肿瘤抑制基因P¹⁶位于9号染色体短臂上（qp21），编码一个由148个氨基酸组成、相对分子量为1.6×10⁴的蛋白质。目前认为，P¹⁶蛋白的作用较为专一，仅在G₁期竞争Cyclin与CDK₄结合，通过抑制CDK₄活性，使其不能催化视网膜易感基因蛋白（PRb）的磷酸化，从而使PRb保持活性状态，抑制细胞增殖^〔1，4〕。Shimizu等^〔5〕应用PCR-SSCP发现人肺癌标本（2／15）有P¹⁶基因突变。Kelley等^〔6〕应用PCR分析人肺癌细胞株，发现非小细胞肺癌P¹⁶基因纯合子缺失率为23％，小细胞肺癌为1％。

　表1　P¹⁶蛋白、VEGF表达与肺癌临床、病理因素的关系

　　注：与高分化肺癌比较，^?P＜0.05；与无淋巴结转移者比较，^△P＜0.01；与Ⅲ～Ⅳ期者比较，^＃P＜0.01

表2　两组P¹⁶／VEGF共同表达情况比较

表3　P¹⁶蛋白、VEGF在肺癌组织中表达的相关性

　　本研究发现，P¹⁶基因的缺失或突变率明显低于P¹⁶蛋白的表达缺失率，尤其是小细胞肺癌，这一差异更明显。可能的解释为：①影响P¹⁶蛋白表达的因素很多，除去基因的纯合子缺失或突变外，非翻译区的微小改变、DNA的甲基化均导致基因的不表达或低表达^〔7〕。②本文检测的蛋白是基因终产物。基因复制、转录、翻译及翻译后修饰等任一环节发生差错，均导致P¹⁶蛋白表达丧失。③本文小细胞肺癌病例少，存在实验误差。因此，我们认为仅检测编码区基因的缺失和突变并不能完全说明P¹⁶基因失活的情况，应辅以免疫组织化学方法检测。本研究结果提示，P¹⁶蛋白的表达与淋巴结转移、肿瘤分期有一定关系，P¹⁶基因失活可能使肺癌细胞获得生长和分裂优势，从而使肿瘤很快进入相对晚期。P¹⁶蛋白检测可作为判断肺癌患者预后的指标之一，与Shapigo^〔1〕的研究结果基本一致。

　　VEGF是1989年Ferrara等^〔2〕在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来，因发现其有促进血管内皮细胞有丝分裂的活性，故称为血管内皮生长因子。由于VEGF具有特异刺激血管内皮细胞增生的能力，因此该因子与肿瘤的关系引起了临床广泛重视。

　　Volm等^〔8〕研究认为，肺肿瘤血管的生成与患者是否吸烟有一定关系，吸烟者易对化疗产生耐药性。本实验结果证实，吸烟量少者肺癌组织中VEGF的表达率明显高于吸烟量多者，与Volm的研究结果基本一致，但其具体机制有待进一步探讨。

　　Berkman等认为，VEGF的表达水平与肿瘤组织血管生成程度及肿瘤的恶性程度显著相关^〔9〕。本文结果亦证实，低分化肺癌者VEGF阳性率明显高于高分化肺癌。

　　本文有淋巴结转移肺癌患者的VEGF阳性率明显高于无淋巴结转移者。Liotta等^〔10〕认为，肿瘤的血管生成可促使肿瘤的体积增加，肿瘤边缘部位的肿瘤细胞易通过静脉―淋巴管吻合处从血液循环中进入淋巴管，肿瘤淋巴结转移的机率随血液循环中肿瘤细胞的增加而增高，因此，肿瘤血管生成对淋巴结转移具有间接的促进作用。也有人认为，这可能是由于淋巴毛细血管网存在，血管形成同时伴有淋巴管的形成所致。由于淋巴结转移和PTNM分期与肿瘤的预后密切相关，因此VEGF的表达可能是肺癌预后不良的标志。

　　综上所述，VEGF表达与癌相关基因的突变率随肿瘤的进展而增加，提示癌基因和抑癌基因可能调节VEGF。现已证明，野生型P⁵³上调可抑制肺癌组织的血管形成；P⁵³可能通过调节VEGF而控制肺癌组织的血管形成^〔11〕。肺癌组织中P¹⁶蛋白下调而VEGF上调，二者呈负相关，但具体机制有待进一步探讨。　参考文献

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　　6，Kelley MJ，Nakagawa K，Steinberg SM，et al.Differential inactivation of CDKN₂ and Rb protein in non-small-cell and small cell lung cancer lines.J Natl Cancer Inst，1995，87：756.

　　7，Geraduts J，Kratzke RA，Niehans GA，et al.Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor／CDKN₂ product P1GINK4A correlation with Rb protein expression.Cancer Res，1995，55（19）：6006.

　　8，Volm M，koomagi R，Mattern J.Angiogensis and cigarette smoking in squamous cell lung carcinomas：an immunohistochemical study of 28 cases.Anti Cancer-Res，1999 Jan-Feb，19（1A）：336.

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　　2000-08-10