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DR-70TM肺癌免疫测定取得可靠试验结果的关键步骤

DR-70TM肺癌免疫测定取得可靠试验结果的关键步骤

数理医药学杂志 1999年第4期第12卷 临床科研分析

作者:吴东方 周新 恩格尔.戴特 安德森.吉娜 弗恩茨.阿里西亚 斯赖特.M.莱文斯纳里斯福.迪耶 吉姆恩斯.帕鲁 高波史夫.汤姆

单位:湖北医科大学附属第二医院 武汉430071

关键词:DR-70TM;免疫测定

  摘 要 中国和美国用DR-70TM(肿瘤标志物)免疫试剂在检测393例健康对照及203例肺癌中的实用性的一个多中心研究,同时也进行了不同疾病和血液收集方法对DR-70TM试验产生干扰的调查。研究发现良性和非癌性疾病能引起DR-70TM水平的提高。

  1 临床样本

  1.1 在中国的研究

  对照组335例样本来自湖北医科大学附属第二医院进行健康体检者。所有血清经静脉穿刺术获得并注入含凝血激活剂SST管中。其中男性190例,女性145例。年龄分布在15~70岁之间。所有的血清都通过甲、乙、丙型肝炎和梅毒的检测,均为阴性。且具有正常的肝、肾及肺功能。

  在83例肺癌患者中,男性55例,女性28例。均为我院进行治疗的临床病,且都通过X光、B超、CT、活组织检查及外科手术等方法确诊的。其年龄分布在29~80岁之间。

  1.2 在美国的研究

  对照组58例血清来源于健康自愿者。

  120例肺癌患者血清来源于奥斯汀医疗中心,其它良性及非癌症性患者血清来源于埃瑞文的加洲大学病理学系。

  2 材料与方法

  2.1 血清 除特殊说明外,所有血清均将经过如下步骤获得。早上空腹抽取大约2ml静脉血,注入有凝血激活剂的玻璃中,置室温30分钟以1500转/分离10分钟取出清澈血清进行分析。为便于比较,将采得血液注入不含凝血激活剂的空管中,制取一定的血清。

  2.2 试剂 由美国AMDL公司提供。

  2.3 仪器 水浴箱、进口洗板机及酶标仪。

  2.4 试验原理 DR-70TM试验利用酶联免疫吸附(ELISA)法,用固定于小孔底部的纯亲和力多克隆抗DR-70TM抗体,去捕获稀释血清中的DR-70TM抗原,被捕捉的抗原,经洗涤后,与过氧化物酶标记的抗DR-70TM。轭合物结合成一个免疫三明治。用TMB显色,终止反应后,在酶标仪450nm处读取光密度,求其含量。

  2.5 DR-70TM测定方法 所有的血清要用试剂盒中提供的稀释缓冲液稀释样本200倍。加血清5ul于1ml的稀释液试管中在充分混合后,将稀释血清加入到稀释板上的两个相邻小孔中,每个孔加入200ul。用一支8道的移液管,从稀释板上吸取100ul稀释血清至反应板相应的孔中,加盖封闭胶,在室温下孵育30分钟,然后上洗板机每孔300ul洗涤6遍,拍干,每孔加酶结合100ul,加盖封闭胶置室温下15分钟,再洗涤6遍,拍干后,每孔加TMB100ul,避免光直接照射,孵育5~10分钟显色。再每孔滴加100ul终止剂终止反应,上酶标仪读取光密度,利用试剂盒中5支标准品作直线回归制成标准曲线,再根据OD值查标准曲线求得DR-70TM含量。

  3 结果

  3.1 对照组中的血清DR-70TM水平

  中国武汉和美国共同的研究中,393例健康对照个体中的正常血清DR-70TM水平波动范围在1mg/L至9mg/L之间。

  3.2 肺癌患者的血清DR-70TM水平

  在中国武汉研究中共有83例肺癌患者,DR-70TM水平在2mg/L至大于700mg/L。根据在335例对照组和83例肺癌患者的测定DR-70TM值,肺癌DR-70TM试验的特异性和敏感性参考可建立在不同的截点水平,见表1。

表1 DR-70TM肺癌免疫测定在不同截点水平的特异性和敏感性

DR-70TM截点水平(mg/L) 特异性% 敏感性%
6.0 97.6 62.0
5.5 97.6 67.5
5.0 96.7 73.5
4.5 94.9 86.7
4.0 89.0 88.0
3.5 88.4 89.2
3.0 86.9 95.2
2.5 83.9 97.6
肺癌患者总数:83
正常总数:335

  在美国的研究中,120例患肺癌者的血清中,其DR-70TM水平波动在1mg/L至51mg/L,利用58例对照组和120例肺癌患者的DR-70TM值,肺癌的DR-70TM试验的特异性和敏感性检测可建立如表2。

表2 DR-70TM肺癌免疫测定在不同截点水平的特异性和敏感性

DR-70TM截点水平(mg/L) 特异性% 敏感性%
16 100 65
12 99 76.6
11 98.1 78
10 98.1 82.5
9 96.2 85.8
8 93.5 86.7
7 88.8 90.8
6 72.2 95
5 45.3 97.5
4 10.1 98.3
肺癌患者总数:120
正常总数:108

  3.3 无凝血激活剂的空管在DR-70TM测量值中的影响

  32例对照个体的血液分别收集在有和没有凝血激活剂的空管中,其结果血清的DR-70TM值分别立即和2倍时间间隔后进行分析,研究结果见表3。

表3 有凝血激活剂空管对无凝血激活剂空管两个时间间隔血清DR-70TM值对照

血清收集空试管 平均DR-70TM水平(mg/L)
新鲜血清:置于室温30min 室温5h 室温48h
有凝血激活剂的空管 5.71 6.13 6.33
无凝血激活剂的空管 5.64 6.53 6.92

  3.4 导致血清DR-70TM水平升高的情况

  已知某些良性、非癌性疾病情况可引起血清DR-70TM水平升高,它们包括肺炎、脓毒症、蜂窝组织炎、急慢性感染、烧伤、创伤、手术、肾功能不全、黄疸和类风湿关节炎等,其DR-70TM水平见表4。

表4 引起血清DR-70TM水平升高的情况

病例编号 临床诊断 DR-70TM(mg/L)
1 感染 12.2
2 神经源性的膀胱炎 11.2
3 克雷伯杆菌膜炎 16.6
4 急性肺炎 20.8
5 50%体表烧伤(2度和3度) 8.9
6 胸部手术创伤 20.6
7 肾功能衰竭 19.4
8 类风湿性关节炎 37.6
9 风湿性关节炎 8.8
10 蜂窝组织炎 20.0
11 脓毒症 15.2
12 黄疸 21.3
13 中毒性的肾功能衰竭 15.0
14 病毒性肺炎 33.4
15 复合型脑外伤 19.6
16 孕妇 13.0
17 泌尿系感染 16.0
18 肺结核 9.7
19 急性白血病 19.5
20 肝炎 10.2

  4 讨论

  为评估DR-70TM用于癌症检测的临床实用性的多中心研究已在三个国家进行(中国、美国和特立尼达)研究中包括了不同非癌症性疾病的影响和实验室因素可以影响DR-70TM试验的结果作相应的解释。

  393例正常健康个体(335例在中国,58例在美国)的DR-70TM水平测得范围为1mg/L至9ml/L。血清DR-70TM水平值依赖于血清的获得方式将发生很大变动。例如,当血液注入无凝血激活剂的空管中,测定血清中的DR-70TM水平数值在获得5小时后将升高16%,48小时将增至20%。

  另一方面,在相同的条件下,当血液取得后注入含有凝血激活剂的空管中,DR-70TM值将分别增至7%和11%。

  一些非癌症性疾病如感染、烧伤、外科手术创伤、关节炎、脓毒症等也可使DR-70TM水平升高。这些效应能导致假阳性结果。因此,需要着重说明的是,DR-70TM免疫测定法检测有无肺癌时,患者必须明确有无前述疾病和使用正确的空管及血液收集方法。

  当一个适宜的参考群体组,即没有上述非癌症疾病的正常健康个体和采用正确的血清收集法。DR-70TM肺癌试验经过ROC曲线分析显示可以取得令满意的良好临床敏感性和特异性。

  作者简介:恩格尔·戴特 安德森·吉娜 吉姆恩斯·帕鲁 美国加州AMDL公司

  弗恩茨·阿里西亚 纳里斯福·迪耶 西印第斯大学化学系

  斯赖特·M·莱文斯 奥瑞吉.加利弗尼亚大学医学系

  高波史夫·汤姆 埃瑞克.威廉姆斯医学科学院妇产科系

  参考文献

  1 Wu,D., Zhou, X., Yang, G.,Xie Y., Hu, Wu., Yang, G., and Lu, M.,(1998), J. Immunoassay, 19(1),63~72.

收稿日期:1999-04-12


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