正常肺、支气管组织与肺癌组织激光诱发自体荧光光谱

中国激光医学杂志 2000年第3期第9卷 论著

作者：王伟　孙玉鹗　周乃康　李峻亨　刘小兵

单位：解放军总医院胸外科　北京市，100853

关键词：肺肿瘤；激光；荧光；光谱分析

　　摘要

　　目的　分析正常肺、支气管组织和肺癌组织的激光诱发自体荧光(LIAF)光谱特征，探讨利用LIAF区分正常肺、支气管组织与肺癌组织的可行性。

　　方法　收集肺癌手术标本42例，每一标本的不同部位即肿瘤组织和正常肺组织及正常支气管组织，分别平均测定4～5条光谱曲线，共测得196个部位的LIF光谱图，其中癌组织74个，正常肺组织67个，正常支气管组织55个。使用三倍频YAG激光（波长355 nm）和光学多道分析仪(OMA)测定各部位的LIAF光谱，读出每条光谱曲线的主峰波长，峰值相对强度，580 nm和600 nm处的荧光强度及其比值(I_580nm/I_600nm)。

　　结果　(1)正常肺、支气管组织和肺癌组织LIAF光谱的主峰波长(nm)差别不大，分别为471.6±5.3、461.9±4.3和463.6±3.6。(2)肺癌组织的峰值相对强度(24 227±4 349)大于正常肺LIAF光谱组织(14 854±4 621)；而支气管的峰值强度最高(51 376±

　　8 332)。(3)正常肺组织在主峰右侧560 nm及600 nm处有两个次峰，正常支气管组织在580 nm与600 nm表现为一小坪，而肺癌组织主峰右侧光谱曲线平滑下降；I_580nm/I_600nm比值在正常肺组织为0.831±0.177，正常支气管组织为1.041±0.117，肺癌为1.269±0.147(P＜0.001)。

　　结论　正常肺、支气管组织和肺癌组织的LIAF光谱有明显区别，利用LIAF区分正常肺、支气管组织与肺癌组织是可行的。

　　中图分类号：　TN249；R734.2　　　文献标识码：　A　　　文章编号：　1003-9430(2000)03-0137-04

　　Laser-induced Autofluorescence Spectroscopy of Normal Lung, Normalbronchus and Lung Cancer

WANG Wei　SUN Yu’e　ZHOU Naikang

　　（Department of Thoracic Surgery）

　　LI Junheng

　　（Department of Laser Medicine）

　　LIU Xiaobing

　　（Department of Pathology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853，China）

　　ABSTRACT

　　Objective　To approach the regularity of laser-induced autofluorescence (LIAF) of normal lung and lung cancer and explore the feasibility of spectroscopy in the differentiation between normal lung tissue, normal bronchial tissues and lung cancer.

　　Methods　The LIAF spectra of normal lung and lung cancer in 42 surgical specimens were examined with a detecting system which consists of an YAG laser(wavelength 355 nm) and an optical multichannel analyzer(OMA), pathological examinations were done in every testing spots.

　　Results　(1)The location of the principle spectral peaks of the normal lung and lung cancer are different, there is a red shift in the peak emission wavelength in the normal lung tissue (471.6 nm±5.2 nm) than that of lung cancer(461.9 nm±4.3 nm) and bronchus(463.6 nm±3.6 nm). (2)The relative fluorescence intensity of the lung cancer(24 227±4 349)is higher than that of the normal lung(14 854±4 621), but the

　　bronchus is the highest(51 376±8 332). (3)In the normal lung tissue spectrum, there are two subsidiary maxima located clearly at 560 nm and 600 nm. The cancer tissue spectrum shows an almost structureless and smoother profile with no subsidiary maxima. The mean relative fluorescence intensity ratio values at 560 nm and 600 nm were 0.831±0.178 for normal lung tissue, 1.041±0.117 for normal bronchus and 1.269±0.147 for lung cancer(P＜0.001).

　　Conclusions　There is a significant difference between the autofluorescence spectra of normal lung, normal bronchus and lung cancer, and it is feasible to differentiate lung cancer from normal pulmonary and bronchial tissues using LIAF spectroscopy.

　　Key words　Lung neoplasms;　Lasers;　Fluorescence;　Spectrum analysis

　　人体组织在一定波长的激发光照射下会发出荧光，即激光诱发自体荧光（LIAF）。因不同组织中荧光物质成分和含量存在着差异，其LIAF光谱各具特征，从而可根据光谱的形态和强度等来区分不同的组织。肺癌的自体荧光光谱较复杂，国内研究较少，国外此方面研究结果不一^［1,2］。我们对42例患者手术切除肺癌标本进行了系统的LIAF光谱图分析，发现了肺癌组织和正常肺、支气管组织的自体荧光光谱特征，为应用LIAF光谱区分肺癌组织和正常肺、支气管组织提供了可靠数据，并为肺癌的激光诱发药物荧光实验打下了基础。

　　材料和方法

　　一、荧光检测系统

　　采用三倍频YAG激光器(图1)。激发光波长355 nm，脉冲宽度10 ns，单脉冲输出能量10 μJ，重复频率5 Hz。以同轴石英光纤传导激光并收集荧光，经多色仪进入光学多道分析仪(OMA)，计算机分析计算并存储打印。

　图1　三倍频YAG激光器检测体外组织样本激光诱发自体荧光光谱示意图

　　Fig.1　Diagrammatic sketch of laser-induced autofluorescence spectrum detecting system in vitro

　　二、标本及LIAF光谱收集

　　收集在我院行肺癌切除的42例患者的肺癌标本。标本切除后1 h内行LIAF光谱测定。每一标本的不同部位，即肿瘤组织、正常肺组织及正常支气管组织分别平均描记4～5条光谱曲线，共获得196个部位的LIAF光谱图，其中癌组织74个，正常肺组织67个，正常支气管组织55个。每描记一条光谱曲线后，立即在该部位标记，将标本送病理科在各标记处取材，行组织病理学检查。

　　三、荧光光谱分析

　　用Graftool软件计算出每条曲线峰值所在的波长位置、峰值相对强度（由OMA系统自行设置，可用任意单位表达）、580 nm处荧光强度（I_580nm）、600 nm处的荧光强度（I_600nm）和I_580nm/I_600nm比值，求出均值和标准差，并用t检验进行统计学处理。

　　结　　果

　　一、组织病理学检查

　　42例中腺癌17例，鳞状细胞癌15例，小细胞癌4例，细支气管肺泡癌4例，大细胞癌和不典型类癌各1例。42例标本中共有196个部位进行了LIAF光谱测定，经组织病理学检查证实，其中74处为癌组织，67处为正常肺组织，55处为正常支气管组织。

　　二、正常肺、支气管组织和肺癌组织的LIAF光谱特征

　　3种组织的LIAF光谱如图2所示，显示以下3个特征。

　　1.主峰波长差异不大　正常肺组织、支气管组织和肺癌组织的LIAF主峰波长(nm)分别为471.6±5.2、463.6±3.6和461.9±4.3，正常肺、支气管组织LIAF主峰位置较肺癌组织向右偏移，但差别不大。

　　2.主峰相对强度差异明显　正常肺组织、正常支气管组织和肺癌组织的LIAF主峰相对强度（任意单位）分别为14 854±4 621、51 376±8 332和24 227±4 349。三者之间两两比较，任意两组之间差异均有非常显著意义(P＜0.001)。

　　3.主峰右侧荧光光谱曲线形状不同　正常肺组织在540～560 nm及580～600 nm处有两个次峰，以580～600 nm波段明显；正常支气管组织在580～600 nm处表现为一小坪；而肺癌组织主峰右侧荧光光谱曲线平滑下降。肺癌组织I_{580 nm}/I_{600 nm}比值明显高于正常肺组织(P＜0.001)和正常支气管组织(P＜0.001)。详见表1。

　图2　1例肺鳞状细胞癌患者的正常肺、支气管组织和肺癌组织的激光诱发自体荧光光谱

　　Fig.2　The LIAF spectra of normal lung, normal bronchus and lung cancer in a patient with squamous cell carcinoma

表1　42例肺癌患者手术切除标本中肺癌与正常肺、

　　支气管组织LIAF的I_580nm、I_600nm及其比值（±s）

　　Tab.1　The fluorescence intensity and ratio at wavelength 580 nm

　　and 600 nm of lung cancer, normal lung and bronchus tissue

　　of surgical specimens in 42 lung cancer patients（±s）

　　* 与肺癌比较 Compared with lung cancer，P＜0.001

　　讨　　论

　　LIAF技术的研究目的在于寻找一种新的早期肿瘤的诊断方法。自80年代初美国加州大学的Profio教授与Doiron博士率先对激光荧光诊断与定位早期肺癌进行了开创性的研究以来，许多国家的学者也纷纷转入该方向的基础研究并取得了一定的成果^［3］。而我国对这一专题的研究起步较晚，研究较少^［4］。用LIAF技术诊断肺癌，首先需分析肺癌组织与正常肺、支气管组织的自体荧光光谱特征规律，找出其间存在的差异，从而制订出能区分肺癌组织与正常肺组织的判断标准。本研究通过对42例患者手术切除肺癌标本共196条LIAF光谱曲线的分析，初步了解了正常肺、支气管组织和肺癌组织的LIAF光谱特征，为利用LIAF区分正常肺、支气管组织和肺癌组织提供了参考数据。

　　本组正常肺、支气管组织和肺癌组织的LIAF光谱曲线显示，三者之间主峰波长位置差异不大，但肺癌组织的峰值相对强度明显高于正常肺组织，而正常支气管组织的峰值相对强度最高。正常肺组织和肺癌组织LIAF的主峰都归因于组织内的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、还原型辅酶A(NADH)和胶原蛋白^［1,5］。支气管中的透明软骨含有较多的胶原蛋白，故其峰值相对强度明显增高。正常组织与癌组织之间的光谱差异主要来自对血红蛋白的吸收^［6］。正常组织在540～560 nm和580～600 nm的两个辅助峰，即是源于对血红蛋白的自我吸收。而肺癌组织的光谱曲线平滑下降，表明肺癌组织中血红蛋白含量的缺乏。据此理论，我们用血红蛋白吸收峰起始处荧光强度与吸收峰值的荧光强度比值即I_580nm/I_600nm比值来反映正常肺组织和肺癌组织的光谱差异。本组肺癌组织的I_580nm/I_600nm比值明显高于正常肺组织和正常支气管组织(P＜0.001)。

　　本组正常肺组织与肺癌组织光谱轮廓形状与Tang等^［1］报道的基本一致。Tang的实验激发光波长为457.9 nm，而本组实验激发光波长为355 nm，虽然实验条件不同，但能取得相近的结果，进一步验证了肺癌组织中血红蛋白的缺乏以及正常肺组织在不同激发光波长的激发下对血红蛋白的吸收特性。

　　值得指出的是，国内谢树森等^［7］报道不同病理类型的肺癌组织其荧光光谱不同，表现为肺鳞癌组织的荧光强度小于正常组织，而肺腺癌的荧光强度大于正常组织。在我们的研究中，则无此差异，原因可能与激发光源与波长不同有关，另外，他们仅测定了2例肺癌标本，其结果有待于进一步验证。

　　本研究在数据处理上采用同一条曲线中不同波长和不同曲线的相同波长的荧光强度比，这大大消除了背景荧光和每次测量时激发光探头与被激发组织的位置、距离以及光源的波动的影响，增加了测量的准确性和可靠性。本组数据为我们下一步确立区分肺癌组织与正常肺、支气管组织的域值并制定诊断标准打下了基础。

　　作者简介：王伟（1963-　），男，河南郑州人，解放军总医院胸外科主治医师，在读博士生，主要从事肺癌的临床早期诊断研究。

参　考　文　献

　　［1］　Tang GC, Pradhan A, Alfano RR. Spectroscopic differences between human cancer and normal lung and breast tissues［J］. Lasers Surg Med, 1989, 9:290-295.

　　［2］　Hung J, Lam S, LeRiche J, et al. Autofluorescence of normal and malignant bronchial tissue［J］. Lasers Surg Med, 1991, 11:99-105.

　　［3］　Profio AE, Doiron DR. Laser fluorescence bronchoscopy for localization of occult lung tumors［J］. Med Phys, 1979, 6:523-525.

　　［4］　郑蔚，谢树森，陆祖康. 用激光荧光法诊断和定位早期肺癌［J］. 激光与光电子学进展，1998, 6:29-40.

　　［5］　Ramanujam N, Mitchell F, Mahadevan A, et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:10193-10197.

　　［6］　Liu CH, Tang GC, Pradhan A, et al. Effects of self-absorption by hemoglobin on the fluorescence spectra from normal and cancerous tissues［J］. Lasers Life Sci, 1990, 3:167-176.

　　［7］　谢树森，李峻亨，张其忠，等. 人肺肿瘤自体荧光与组织病理学类型的关系［J］. 中国激光医学杂志, 1995, 1:18.

(收稿日期：1999-12-14)