周围型肺癌微血管密度与CT增强的关系

中华放射学杂志 1999年第10期第33卷 呼吸系统放射学

作者：刘士远　周康荣　肖湘生　叶挺军　张志勇

单位：200003 上海，第二军医大学长征医院影像科（刘士远、肖湘生），病理科（叶挺军）；上海医科大学中山医院放射科（周康荣、张志勇）

　　关键词： 肺肿瘤；体层摄影术；X线计算机；X线影像增强

　　【摘要】　目的　探讨周围型肺癌微血管密度（MVD）与肿瘤预后以及CT增强程度的相关性。方法　利用免疫组织化学方法测定了127例周围型肺癌的MVD，并与CT增强程度（87例回顾性，40例前瞻性动态增强）以及转移、预后情况进行对照分析。结果　瘤内微血管的分布以肿瘤外围浸润前沿及间质中较为密集，肿瘤实质区及坏死区血管稀疏。回顾组与前瞻组腺癌的MVD均明显高于鳞癌，回顾组分别为57.6±18.4与41.5±20.1（t=2.745,P＜0.01）；前瞻组分别为61.4±9.9与45.1±11.2（t=2.385，P＜0.05)，而且分化差的高于分化好的。从淋巴结转移及随访情况看，MVD高与淋巴结转移、远处转移及3年存活率低关系密切。肺癌相对CT值的变化与微血管密度呈正相关，回顾组肿块增强≥30 HU及＜30 HU的MVD分别为57.1±22.7(69例)及42.7±18.4(18例)，差异有显著性意义（t=2.669,P＜0.01）。前瞻组40例肺癌平均增强50.6±19.6 HU，增强高峰在注射对比剂后1分钟左右，MVD与CT增强的相关系数为0.887 4，P＜0.001。虽然腺癌的增强幅度高于鳞癌（53.4±23.2 HU 及47.2±14.6 HU），但并无统计学意义(t=1.546,P＞0.05)。结论　周围性肺癌MVD与预后密切相关，肺癌增强的幅度及模式与其血供及微血管密度有关，动态增强可以反映肺内结节的增强特点，有助于结节的鉴别诊断。

The relationship between microvessel density and CT enhancement of the peripheral lung cancer

LIU Shiyuan

　　Department of Radiology,

　　ZHOU Kangrong, XIAO Xiangsheng, et al.

　　Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003

　　【Abstract】　Objective 　To investigate the relationship between microvessel density (MVD), clinical prognosis and CT enhancement of the peripheral lung cancer.Methods　127 cases of peripheral lung cancer were examined with CT (87 cases retrospectively and 40 cases prospectively), and MVD were measured with immunohistochemical method by factor Ⅷ on the specimens of the resected tumors. The results were analyzed and compared with CT enhancement, metastasis and prognosis.Results　The MVD was higher in the peripheral junction zone and interstitial areas than that in the parenchymal areas and necrotic zones of the tumors. Patients with nodal metastasis had higher MVD than those without nodal metastasis(56.9±18.1 versus 43.8±23.6,P＜0.01).Those patients who died or had remote metastasis also had higher MVD than the survived patients without remote metastasis(56.8±24.4 and 57.6±18.9 versus 46.4±22.3,P＜0.05).Both the retrospective group and prospective group, showed much higher microvessel density in adenocarcinoma than in the squamous ones (57.6±18.4 versus 41.5±20.1 and 61.4±9.9 versus 45.1±11.2) with significant difference(P＜0.05); and the worse the degree of tumor differentiation, the higher the microvessel count. The MVD of tumors with enhancement higher than 30 HU (69 cases) was significantly higher than those (18 cases)with enhancement less than 30 HU(57.1±22.7 vs 42.7±18.4,P＜0.01) in the retrospective group. In prospective study, the mean enhancement value in 40 patients was 50.6±19.6 HU, and the peak value appeared at about 1 minute after administration of contrast agent. The mean enhancement value of adenocarcinomas was 53.4±23.2 HU (maximum 83 HU, minimum 18 HU), higher than that in squamous cell carcinomas (mean value 47.2±14.6, maximum 72 HU, minimum 13 HU ) but without significant difference (P＞0.05); but the enhancement of the lung cancer correlated well with MVD (r=0.887 4).Conclusions　Measurement of the microvessel density of tumor can determine the degree of angiogenesis of neoplasm and predict the metastasis or prognosis of the lung cancer. Angiogenesis not only constitutes the basis of enhancement of the tumor, but also determine the various degrees and patterns of enhancement. Spiral dynamic CT is the technique ideal to demonstrate the enhancement features, which might be helpful in making differential diagnosis of pulmonary nodules.

　　【Key words】　Lung neoplasms　　Tomography,X-ray computed 　　Radiographic image enhancement

　　肺癌的生物学行为、恶性程度及预后受分子生物学因素的控制，微血管密度(microvessel density, MVD)就是重要的分子生物学因素之一。研究表明，肺癌MVD高与肺癌预后显著相关^［1-6］。肺癌形态学表现是受分子生物学因素控制的，肺癌在CT上的各种征象尤其是强化程度和模式理应与MVD存在某种内在的联系，但笔者目前尚未见有关文献报道。本研究的目的是揭示肺癌增强与其微血管密度的关系。

　　材料与方法

　　一、一般资料

　　回顾组：选择1994年5月至1995年5月间接受CT检查并行手术切除的周围型肺癌87例。病例选择标准：有平扫及增强，增强前后测量CT值；手术记录及病理报告完整(包括淋巴结转移情况)。患者年龄31～75岁，平均(57.4±13.4)岁，其中男66例，女21例。鳞癌37例，其中低分化15例，中分化20例，高分化2例；腺癌41例，其中低分化、中分化和高分化分别为12、27例及2例；腺鳞癌5例，其中中分化3例，低分化2例；小细胞未分化癌3例；大细胞癌1例。全部病例均有3年以上的随访，随访资料完整的75例，其中3年生存率76.0％(57/75例)，远处转移率19.3％(11/57例)，死亡率24.0%(18/75例)。

　　前瞻组：共40例，男28例，女12例，年龄45～77岁，平均(56.2±6.9)岁。其中鳞癌17例，腺癌23例（其他组织类型的肿瘤因例数少，本研究未包括在内）。

　　二、CT扫描方法

　　回顾组：应用GE 9800 Quick或Highspeed Advantage CT扫描机。先在病灶层面平扫，然后行增强扫描。常规增强方法(9800 Quick)为：1.5 ml/kg对比剂，注射速率1.5 ml/s，延迟25～35秒扫描。常规层厚10 mm，病灶较小者再行3～5 mm薄层扫描。螺旋CT增强方法为：对比剂剂量及层厚同前，速率2 ml/s，延迟45秒。用纵隔窗及肺窗分别观察，并测量增强前后的CT值。

　　前瞻组：机器型号同回顾组。对准备手术的周围型肺癌，术前进行增强前和增强后动态CT扫描。具体方法：应用非离子型对比剂， 1.5 ml/kg，注射速率2.5～3.0 ml/s，注入对比剂后30秒及1～4分钟分别行病灶扫描，扫描参数为：3 mm层厚，螺距1.0～1.2，较大病灶3 mm重建，较小病灶1～2 mm重建。选择肿瘤实质区测量增强前后CT值，注意测量部位的前后对应。

　　三、免疫组织化学标记微血管

　　常规制备5μm涂胶白片。采用鼠抗人Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧRAg)单克隆抗体(1:100,Dako公司)，以生物素-抗生物素复合物技术（ABC法）进行免疫组织化学染色(试剂盒购自Dako公司)。步骤如下：切片经二甲苯脱脂，各级酒精水化至水。3%双氧水、甲醇液室温封闭内源性过氧化物酶活性20分钟。磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4)洗3次，每次5分钟(下同)。1∶10的小牛血清封闭非特异性抗原20分钟(37℃)。加稀释的抗F-ⅧRAg抗体，1∶100，4℃冰箱过夜。阴性对照以PBS代替第一抗体。PBS洗。加鼠抗兔IgG第二抗体，1∶200，37℃孵育45分钟。PBS洗。加1∶100 ABC复合物，37℃孵育30分钟。PBS洗， 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色5～10分钟后用PBS中止，自来水冲洗。PBS洗，苏木素套染30秒，脱水透明，常规封片。

　　四、检测及统计方法

　　先在低倍镜(×100)下全面观察切片以确定肿瘤内血管密度最高处，血管较少的硬化区及正常组织交界区不作血管计数区，找出血管密度最高处后，在高倍镜(×200,0.74 mm²/视野)下以与周围肿瘤组织及结缔组织成分明显区别的任何1个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为1条血管，只要结构不相连，其分支结构也作为1条血管计数。记录5个视野内的微血管数，取平均数作为该病例的MVD。如果200倍视野计数困难，可在400倍视野下计数，同样计数5个视野，但最后结果须加倍（图1）。红细胞的出现及是否有管腔不作为计算标准，管腔大于8个红细胞直径且带有较厚肌层的血管也不作血管计数。比较各CT征象对应的MVD，统计学处理应用均数间t检验及Spearman相关分析，由统计分析软件包SPSS系统完成。以P＜0.05作为有统计学意义。

图1　肺腺癌免疫组织化学Ⅷ因子染色，高倍镜（×400）,示肺癌微血管密度的记数方法　图2　右上肺腺癌。 免疫组织化学Ⅷ因子染色，高倍镜（×400）观察，微血管密度70左右　图3　右上肺鳞癌。免疫组织化学Ⅷ因子染色，高倍镜（×200）观察，可见瘤细胞密集，微血管密度只有27

　　结果

　　切片中肺癌组织的小动脉、小静脉及毛细血管以及所有有血管内皮的地方均染色阳性，未加Ⅷ因子抗体的对照组未见染色。瘤内微血管的分布以肿瘤外围浸润前沿及间质中较为密集，肿瘤实质区及坏死区血管稀疏。微血管多无明显管腔，或仅有不规则的管腔；可以是单个内皮也可以是簇状分布的内皮（图1～3）。

　　一、肺癌的MVD

　　回顾组：本组87例肺癌的MVD从17～74不等，平均值为52.7±19.6。其中鳞癌37例，平均MVD 41.5±20.1；腺癌41例，平均MVD 57.6±18.4。两者间差异有显著性意义(t=2.745,P＜0.01)。鳞癌及腺癌各组织类型分级之间，分化差的略高于分化好的，但差异无显著性意义(P＞0.05)。

　　前瞻组：鳞癌与腺癌的MVD分别为45.1±11.2及61.4±9.9，统计学有显著性意义(t=2.385,P＜0.05)（图2，3）。

　　二、各类肺癌MVD与淋巴结转移的关系（回顾组）

　　无淋巴结转移者36例(41.3%)，有转移者51例(58.7%)，两组的MVD差异有非常显著性意义（表1）。其中肺门转移45例，同侧纵隔转移28例，对侧纵隔转移3例。

表1　各类肺癌MVD与淋巴结转移的关系

　　注：MVD为微血管密度。统计学处理表明，除了其他组由于病例较少差异无显著性意义外，鳞癌(t=2.846)、腺癌(t=2.907)以及总体转移与非转移组之间(t=2.694)差异有非常显著性意义(P＜0.01)　　三、MVD与术后生存期的关系

　　回顾组病例只有3年随访资料，所以只计算3年存活率，87例病人75例有完整随访资料，目前死亡18例，57例存活，其中11例已有转移，3年存活率76%(57/75)。死亡者及远处转移者的MVD明显高于存活无远处转移者(t=2.046及2.193,P＜0.05，表2）。

表2　回顾组不同状况病例MVD的比较

　　注：MVD为微血管密度　　四、MVD与肿块CT增强幅度的关系

　　回顾组：按照增强后肿块CT值的净增数即强化值，将肺癌肿块强化值分成≥30 HU及＜30 HU两

　　类，其MVD分别为57.1±22.7(69例)及42.7±18.4(18例)。两者差异有非常显著性意义（t=2.669, P＜0.01），尤其是强化值超过60 HU的病例，较＜30 HU者的差异更加显著。

　　前瞻组：40例肺癌直径最大6 cm，最小2 cm，平均3.5 cm。平均增强50.6±19.6 HU，其中鳞癌平均47.2±14.6 HU，最大72 HU，最小13 HU；腺癌平均53.4±23.2 HU，最大83 HU，最小18 HU。虽然腺癌的增强幅度高于鳞癌（图4～7），但并无统计学意义(t=1.546,P＞0.05)。鳞癌及腺癌平扫与增强后平均CT值变化见图8。将每例肺癌最大CT值的变化（增强后最大CT值与平扫CT值之差）与MVD通过Spearman法进行双因素相关分析，结果r=0.887 4，P＜0.001，提示两者呈正相关（图2～7）。

图4　右下叶背段腺癌。动态增强早期可见瘤体强化不均匀，如果测量 CT值的兴趣区过大，因部分容积效应易导致结果偏低　图5　同图2病例。动态增强30秒扫描，示病灶实质部分没有明显强化　图6　同图2病例。1分钟以后瘤体强化显著，最高达110 hU(强化幅度接近90 HU)　图7　同图3病例。CT增强示病灶强化不明显

图8　肺癌的动态增强曲线。图中C-表示平扫，C+表示增强，1～5分别表示注入对比剂后30秒及1～4分钟5个时间点

　　讨论

　　一、肺癌MVD与预后及转移的关系

　　血管生成在肿瘤的转移中起着关键性作用^［1］。肿瘤细胞的转移必须有3个条件，或者说有3个步骤：一是进入血管;二是在血流中存活;三是种植并在靶器官上生长。这3个环节都离不开血管生成。肿瘤细胞入血主要通过瘤内新生血管或被肿瘤破坏的宿主血管，在肿瘤血管生成过程中瘤细胞进入循环也有3个途径：一是新生血管内皮的裂隙。新生血管的特点是无平滑肌细胞及神经末梢，只有一层内皮细胞。由于内皮细胞的基底膜不完整，肿瘤细胞容易穿透渗漏，这为肿瘤进入循环提供了条件；二是各种降解酶的激活与释放可帮助肿瘤细胞进入血流；三是新生的血管内皮可能包埋肿瘤细胞并将其带进血管内。实际过程可能是数种方式并存，没有血管生成，瘤细胞极少脱落至血循环中，转移瘤也无法生存及增殖。因此，计算原发肿瘤周边血管数目，可判断血管生成程度及预测转移。Angeletti及Giatromanolaki等^［2，3］ 的研究结果都强烈提示肿瘤血管密度是判断肺癌转移及预后的最重要指标。本组病例发生淋巴结转移的MVD明显高于无转移组，3年随访存活的远处转移组及死亡组病例的MVD也明显高于存活无转移组。这充分说明了肿瘤微血管密度与肿瘤预后及转移的密切关系。从MVD与肿瘤细胞类型及分化程度的关系看，腺癌的微血管密度明显高于鳞癌，分化差的高于分化好的，这可能是腺癌以及分化差的肺癌转移多、预后差的原因之一。

　　二、肺癌增强与MVD的关系

　　关于血管生成与影像的对照研究已有报道，但大多是动物实验及乳腺癌方面的，而且以磁共振为主^［4-8］。大多数研究表明，肿瘤周边部血管丰富，增强明显；对应的组织学切片上血管密度也增大。这提示，活体MRI增强对肿瘤血管密度的判断与标本免疫组织化学方法所得的血管密度相仿，使得非创伤性方法测量血管密度预测肿瘤转移及预后成为可能。CT评价血管生成的文献很少，1989年Zagzag等^［4］对兔脑移植VX2肿瘤CT增强与血管生成关系的研究表明，脑内肿瘤的CT增强基础是瘤内微血管的增生。在肺癌方面，Yamashita 等^［9］将肿瘤内部的血管按管径分成大(＞0.1 mm)、小(0.02～0.1 mm)两组，统计学处理表明肿瘤的强化幅度与小血管的相关性大于大血管（r=0.77及r=0.59），这种小血管相当于毛细血管。但肿瘤内的小血管不完全是毛细血管，还包括一些毛细血管前期结构，所以更准确的判断应当是计算肿瘤的微血管密度。从我们研究的结果看，肿瘤的微血管密度与其相对CT值的变化密切相关，也就是说，MVD的高低决定着肿瘤的增强程度（图2，3，5～7）。这同时提示我们利用活体CT增强无创性判断肿瘤的微血管密度是完全可能的，肺癌增强明显者，MVD高，有可能预后不良。

　　三、螺旋CT对周围型肺癌的增强价值

　　螺旋CT的应用，使孤立性肺结节（SPN）增强模式及增强曲线的研究更为方便和可靠，提供的诊断信息更多，从而提高了鉴别诊断的可能性和准确性。由于所用方法以及机器设备等的不同（包括对比剂用量、注射速度、延迟时间等），周围型肺癌动态增强的结果和意义尚存在争论。Swensen等^［10］对52例肺内恶性结节的研究表明（1.5 ml/kg,2 ml/s,螺旋CT）：平均增强(49.5±3.2) HU，增强幅度最高达110 HU，最低为11 HU。Zhang 等^［11］采用100 ml对比剂，4 ml/s的速度，对42例肺癌行螺旋CT扫描，肺癌平均增强幅度为(41.9±2.8) HU，增强高峰在1分钟左右。本组40例肺癌平均增强(50.6±19.6) HU，其中鳞癌平均(47.2±14.6) HU，最大72 HU，最小13 HU；腺癌平均(53.4±23.2) HU，最大83 HU，最小18 HU。增强峰值大都出现在1分钟左右。虽然腺癌的增强幅度高于鳞癌，但并无统计学意义(P＞0.05)。之所以两组肺癌CT增强程度的比较结果与MVD比较结果不同（两组MVD相差非常显著），我们推测可能与以下两方面因素有关：一是病例数尚不够多，二是病变的选择包括了一些瘤径在3 cm以上的肿块，这可能影响了统计结果。至于本组增强幅度略高于其他作者，可能因为，一是扫描条件不同，其次与测量CT值的方法也有关系。根据我们的经验，肺癌在 3～4 ml/s的速度注射对比剂的增强早期，强化往往很不均匀，因此如果兴趣区较大，势必使测量结果偏低(图6)。我们测量CT值都选择每例病人增强最明显区域（同一例病人增强前后测量CT值的兴趣区大小及位置相同），但每个病人因增强显著区域的面积不同，所以它们的兴趣区大小也不固定。我们认为这样才能真正反映结节的强化特点。

　　增强峰值的大小及出现时间，一方面取决于技术因素，主要指增强的方式，包括对比剂用量、注射速度、延迟时间等。另一方面取决于其内部因素，即血供特点：一是肿瘤的小血管，主要指瘤体附近及瘤内间质的供血小动脉及小静脉；二是肿瘤间质及实质内的微血管，包括毛细血管及未成型的毛细血管前期结构；三是肿瘤的弥散功能，指对比剂通过微血管弥散到肿瘤实质的速度及程度。恶性结节的微血管基底膜不完整，对比剂透过容易，弥散可能较快；而良性病变微血管基底膜完整，对比剂透过可能较慢。这就有可能影响不同性质结节的增强模式，为有效的鉴别诊断提供可能。螺旋CT动态增强能够反映整个动态增强的变化过程（图8），所以鉴别肺内良恶性结节完全是有可能的，但需要进一步更加详细地进行研究。

　　参考文献

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　　3　Giatromanolaki A, Koukourakis M, O′Byrne K, et al. Prognostic value of angiogenesis in operable non-small cell lung cancer. J Pathol,1996, 179:80-88.

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　　10　Swensen SJ, Brown LR, Colby TV, et al. Lung nodule enhancement at CT: prospective findings. Radiology, 1996,201:447-455.

　　11　Zhang M, Kono M. Solitary pulmonary nodules: evaluation of blood flow patterns with dynamic CT. Radiology, 1997, 205:471-478.

(本文编辑:任晓黎)

(收稿:1999-03-18　　修回:1999-05-10)