用差异显示法研究云锡矿工肺癌组织相关基因

中华放射医学与防护杂志 1999年第4期第19卷 基础研究

作者：杨梅英 叶常青 姚树祥 张俊 陈剑云 刘雷华

单位：100850 北京放射医学研究所(杨梅英、叶常青、陈剑云、刘雷华)；云南锡矿劳动防护研究所(姚树祥、张俊)

关键词：差异显示；矿工；肺癌；相关基因

　　【摘要】目的 为探讨矿工肺癌发生的机理，作者研究了与云锡矿工肺癌组织相关的基因。方法 以云南锡矿工肺癌切除术的癌组织和正常肺组织为样品，用差异显示法比较两种组织差异表达基因，并将其克隆测序。结果 在肺癌组织和同例正常肺组织中发现有30个表达差异的基因片段。其中，16个片段仅在肺癌组织中表达而不在正常组织中表达；14个片段仅在正常组织中表达而不在肺癌组织中表达；测定了6个片段的序列。CG2、CG7、CG8、CA5和CC6 5个序列在Genbank中未查到有75%同源的序列，被认为是新序列并在Genbank中登录。CG3与人核糖体蛋白L27a有95%同源性。结论 在矿工肺癌组织和同例正常肺组织中有已知和未知的表达差异基因存在。

Search for genes related to tin miners’lung cancer tissues by differential display of mRNA

YANG Meiying,YE Changqing,YAO Shuxiang,et al.

　　Institute of Radiation Medicine,Beijing,100850, China.

　　【Abstract】Objective To search for the genes related to tin miners’lung cancer tissues.Methods Differential display of mRNA.Results Thirty cDNA fragments which differentially expressed in lung cancer tissues and the same patients’ normal lung tissues were discovered.Among these,16 expressed in lung cancer tissues,not in normal lung tissues;14 expressed on the contrary.Six cDNA fragment sequences were determined ,of which 5 sequences coded CG2,CG7,CG8,CA5 and CC6 had less than 75% of homology with known sequences in GenBank BLAST,so they were believed to be new sequences which we have recorded in Genbank.Only one fragment sequence coded CG3 had up to 95% of homology with human ribosome protein L27a gene.Conclusion mRNA differential display provides a unique and powerful experimental system to study differential gene expression in tin miners’ lung cancer tissues and the same patients’ normal lung tissues.Using the system,differential expression of 30 cDNA fragments was observed.Six of them may be used in study on molecular mechanism of miners’ radon-associated lung cancer.

　　【Key words】 Differential display Tin miners Lung cancer Related genes

　　云南个旧锡业公司矿工中肺癌患病率明显高于正常人群［1］。存在于云锡矿山井下作业环境空气中的放射性氡及其衰变子体是云锡矿工肺癌高发的主要病因［2］。在辐射致肺癌的分子机理研究中，目前有两方面的工作，一是广泛研究已知癌基因、抑癌基因的变化规律［3，4］；另一方面是研究辐射致癌的相关基因。差异显示法［5］促进了相关基因探索这一领域的发展。本实验应用差异显示法研究了一例锡矿矿工手术切除肺癌组织及正常肺组织表达差异的基因，找出30个表达差异的基因片段。6个仅在肺癌组织中表达的基因被克隆测序，并对其生物学功能进行了初步探讨。

　　材料和方法

　　1.组织及RNA提取：组织样品系一例行肺癌切除手术的矿工肺癌组织和同例正常肺组织(由云南个旧锡矿劳动防护研究所提供)，患者年龄56岁，在云南锡矿井下累计工作46年，临床诊断为肺腺癌，有吸烟史。手术后立即将组织置干冰中保存并运至实验室。组织样品均采用一步热酚法提取RNA。

　　2.引物：购自GenHunter公司，3’端引物有3条，其序列为：5’-AAGCTTTTTTTTTTTTTM(G,A,C)-3’，总称为HT11M(G，A，C)。5′端引物采用HAP1-8其序列为：HAP1：5′-AAGCTTGATTGCC-3′，HAP2：5′-AAGCTTCGACTGT-3′，HAP3：5′-AAGCTTTGGTCAG-3′，HAP4：5′-AAGCTTCTCAACG-3′，HAP5：5′-AAGCTTAGTAGGC-3′，HAP6：5′-AAGCTTGCACCAT-3′，HAP7：5′-AAGCTTAACGAGG-3′，HAP8：5′-AAGCTTTTACCGC-3′。将3′端和5′端引物随机配24对。

　　3.mRNA差异显示：差异显示参照Liang 方法［5］进行，并做适当改进，即PCR扩增反应物中不加同位素，在6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用硝酸银染色凝胶。

　　4.差异片段的回收和再扩增：自6%变性聚丙烯酰胺凝胶上切下两种组织表达有差异的片段，100 μl dH2O中浸泡10分钟，沸水浴15分钟，12 000g离心2分钟去除凝胶残渣，上清转入另一管中加入1/10体积3 mol/L醋酸钠，无水乙醇沉淀，-20℃过夜。离心，85%乙醇漂洗，加入 10 μl dH2O溶解。将差异片段进行再扩增，PCR反应条件基本同上，反应体积为 40 μl，dNTP为 250 μmol/L，DNA模板 4.0 μl，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。

　　5.基因片段的克隆及序列分析

　　(1)载体及菌株：pGEM-TEasy载体购自Promega公司。该载体含有T7和Sp6启动子及多克隆位点，在多克隆位点的两端含有3′-T末端，其表达LacZ基因产物的氨基酸片段，在相应的宿主中可出现α-互补便于鉴定阳性克隆。该载体试剂盒同时提供宿主菌JM109。

　　(2)片段克隆及序列分析：片段与pGEM-TEasy载体连接，转化JM109菌株，酶切鉴定插入片段大小。克隆片段的核苷酸序列分别从T7启动子和Sp6启动子两侧读出序列，并与Gene Bank核苷酸数据库(BLAST)的已知序列进行类似性比较，将未知的差异序列在数据库中登录。

　　结果

　　1.RNA提取：云南个旧锡矿矿工肺癌组织和同例正常肺组织RNA含量分别为 0.19 μg/μl,0.22 μg/μl；其A260/A280均大于1.7，说明RNA含量的纯度很高，可以用于进一步的实验。

　　2.差异显示片段：从肺癌组织和正常肺组织中提取的RNA反转录为cDNA，用HT11M(G，A，C)与HAP1～8配对引物对cDNA单链进行PCR扩增，产物经测序凝胶电泳，硝酸银染色(见图1)。发现肺癌组织和同例正常肺组织有表达差异基因片段30条，其中16条仅在肺癌组织中表达，而正常组织中不表达；14条仅在正常组织中表达，而肺癌组织中不表达。

图1 肺癌组织和正常肺组织差异显示图

在HT11G存在下对RNA进行反转录为cDNA，加入HAP3进行PCR扩增；箭头所示肺癌组织表达，正常肺组织不表达差异片段

　　3.cDNA片段的重扩增：30个差异片段均进行重扩增，共扩增出24条，回收率可达80%。图2显示部分重扩增片段。在下一步实验中取仅在肺癌组织中表达，琼脂糖凝胶电泳时片段大于或等于 100 bp的6个片段进行克隆和测序。这6个片段分别为CG2、CG3、CG7、CG8、CC6和CA5(命名规则：第一个字母C为癌组织；第二个字母为3’端引物；1～8为5’引物)。

图2 PCR重扩增的差异片段的琼脂糖凝胶电泳

　　4.阳性重组子的鉴定：提取CG2、CG3等6个片段的质粒，经EcoR Ⅰ酶切，鉴定插入片段及其大小(见图3)。插入片段同PCR产物大小一致。

图3 阳性重组子的限制性酶切分析

　　5.克隆片段的序列分析：CC6从T7启动子和Sp6启动子两侧读出序列，其余片段只从T7启动子一侧读取核苷酸序列，与载体克隆位点序列和引物序列比较，所得到核苷酸序列如下：

　　从DNA序列分析证实所有克隆片段均含有5′端和3′端引物。

　　6.序列的同源性分析：将上述获得的序列与Gene Bank的BLAST数据库的已知序列进行同源性比较，发现：CG2、CG7、CG8、CA5、CC6没有满足同源性达75%以上的序列，认为是新序列，将CG2、CG7、CG8、CA5、CA5-1在Gene Bank中进行登录，登录号依次为：AF077293，AF077294，AF077295，AF077296，AF077297。CG3与人核糖体蛋白L27a的序列同源性达95%，说明该序列为人核糖体蛋白L27a。

　　讨论

　　差异显示技术是研究基因表达的一种方法，建立于90年代初期，与减法杂交、足迹法比较，具有简便、迅速、重复性高的特点。差异显示法用于癌症机理研究的报道很多，其主要用于研究两种细胞表达差异基因的比较，如人正常乳腺细胞和乳腺癌细胞^［6］，人前列腺组织上皮和前列腺癌细胞系^［7］。而直接用于手术切除的癌组织报道较少，1995年Huang等^［8］率先选用20例癌组织样本，用差异显示法研究了肝癌相关基因。作者将该技术按Liang P等^［9］报道的方法在永生化人胎气管成纤维细胞样品中做了初步研究^［9］，之后作了部分改进引入对矿工肺癌组织样品的研究。

　　本实验就回收的6个片段进行了克隆、测序和与Gene Bank中的核苷酸数据库内的已知基因做了同源性比较。其序列分析结果证实CG2、CG3、CG7、CG8、CA5、CC6 6个片段均含有3′端锚定引物和5′端随机引物，说明这6个片段均为特异性扩增片段。CG3基因片段与人核糖体蛋白L27a有95%的同源性，表明CG3为人核糖体蛋白L27a。Frigerio等［10］从人结肠癌cDNA文库中首次分离到L27a，含有503个核苷酸，5’端含有16个碱基的非翻译区，444个碱基的开放阅读框架，3’端含有41个碱基的非编码区，在第467个碱基处含有poly(A)尾信号ATTAAA。编码蛋白由148个氨基酸组成，理论上分子量为16 559。与大鼠该基因相差3个氨基酸。

　　目前，有关核糖体在癌症中的作用有一些报道。在正常情况下细胞中核糖体蛋白与rRNA以同样的化学计量级产生以便于组成核糖体^［11］。在某些文库中核糖体蛋白的表达则发生改变，如结肠癌中核糖体蛋白过渡表达^［12］，有时与肿瘤的转移性有关^［13］。L27a在结肠癌文库中表达较正常组织高11倍^［10］。作者的结果表明L27a在锡矿矿工肺癌组织中过渡表达，这与资料报道基本一致。有关人核糖体蛋白在肿瘤组织中表达升高的机理有待于进一步证实。

　　CG2、CG7、CG8、CA5和CC6 5个片段与基因数据库中的已知序列没有同源序列。为了进一步探讨这些基因与肺癌的相互关系，分离这些基因片段的全长基因并研究其功能，作者构建了锡矿矿工肺癌组织的cDNA文库。总之，本实验结果证实差异显示技术可用于分析肺癌组织表达差异基因。作者应用24对引物获得了一些在肺癌组织中表达发生改变的基因。该方法可进一步扩展至用所有的引物对研究整个肺癌组织和正常组织中的表达基因。此方法可准确详细地描述肺癌组织基因的表达情况。本实验所得到的3’端cDNA可用于从肺癌组织cDNA文库中分离更长或全长cDNA，以研究基因功能。

　　本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39600043)

　　参考文献

　　1 姚树祥.氡暴露与云锡矿工肺癌.氡水平、效应及危害评价专题讨论会.苏州：1995.110-112.

　　2 Yao Shuxiang,Lubin JH,Qiao YL,et al.Exposure to radon progeny,tobacco and lung in a case-control study in Southern China.Radiat Res,1994,138:326-336.

　　3 Hussain SP,Kenney CH,Amstad P,et al.Radon and lung carcinogenesis:mutability of p53 codons 249 and 250 to 238Pu alpha-particles of human bronchial epithelial cells.Carcinogenesis,1997,18:121-125.

　　4 Taylor JA,Watson MA,Deverux TR,et al.p53 mutation hotspot in radon-associated lung cancer.Lancet,1994,343(8889):86-87.

　　5 Liang P,Zhu W,Zhang X,et al.Differential display using one-base anchored oligo-dT primers.Nucleic Acids Res,1994,22:5763-5764.

　　6 Liang P,Averboukh L,Keyomaris K,et al.Differential display and cloning of messenger RNAs from human breast cancer versus mammary epithelial cells.Cancer Res,1992,52:6966-6968.

　　7 Wang FL,Wang Y,Wong WK,et al.Two differentially expressed genes in normal human prostate tissue and in carcinoma.Cancer Res,1996,56:3634-3637.

　　8 Huang LR,Hsu HC.Cloning and expression of CD24 gene in human hepatocellular carcinoma:a potential early tumor marker gene correlates with p53 mutation and tumor differentiation.Cancer Res,1995,55:4717-4721.

　　9 杨梅英，叶常青，吴德昌，等. α粒子诱发人胎气管永生化成纤维细胞恶性转化相关基因的分析. 中华放射医学与防护杂志，1997，17：166-168.

　　10 Frigerio JM,Dagorn JC,Iovanna JL,et al.Cloning,sequencing and expression of the L5,L21,L27a,L28,S5,S9,S10 and S29 human ribosomal protein mRNAs.Biochim Biophys Acta,1995,1262:64-68.

　　11 Mager WH.Control of ribosomal protein gene expression.Biochim Biophys Acta,1988,949:1-15.

　　12 Barnard GF,Staniunas RJ,Mori M,et al.Gastric and hepatocellular carcinomas do not overexpress the same ribosomal protein messenger RNAs as colonic carcinoma.Cancer Res,1993,53:4048-4052.

　　13 Barnard GF,Staniunas RJ,Bao S,et al.Increased expression of human ribosomal phosphoprotein P0 messenger RNA in hepatocellular carcinoma and colon carcinoma.Cancer Res,1992,52:3067-3072.

(收稿:1999-01-10 修回:1999-05-04)