阻断TGFα-EGFR自泌环对胰腺癌细胞体外生长的影响

　　中国医学科学院学报1999年第21卷第1期

许雅　刘彤华　高洁

　　摘　要　目的　研究阻断TGFα-EGFR自泌环对胰腺癌细胞生长的影响。方法　构建了反义EGFR的表达载体pCMV-AS-EGFR，转染已经反义TGFα转化的胰腺癌PC-7细胞，经G418筛选，获得稳定的双重转化细胞系PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR。经Southern blot、Northern blot、¹²⁵I-EGF结合试验分析双重转染细胞系基因的整合及表达。DNA凝胶电泳、流式细胞术、原位凋亡检测细胞凋亡。结果　双重转染细胞系有外源TGFα基因的整合及表达，内源性EGFR及cyclin D1 mRNA表达下调、细胞表面EGFR受体表达下降，与反义TGFα单独作用比较，反义EGFR与反义TGFα的联合作用更强。³H-TdR掺入率由25%降至14.5%。生长抑制率由78.8%提高到86.0%、软琼脂集落形成能力完全丧失。双重抑制后，细胞更容易发生凋亡。结论　对胰腺癌中异常信号传导途径的阻断，能明显地抑制肿瘤恶性生物学行为，使肿瘤细胞恶性表型部分逆转。

　　关键词：胰腺癌　TGFα　EGFR　反义核糖核酸　细胞凋亡

　　恶性肿瘤细胞的无限制自主性生长行为与自分泌的细胞调节方式有关系。在许多细转化途径中以及肿瘤细胞生长过程中，TGFα作为自泌生长因子起作用，TGFα和EGF均为EGFR的配体，通过与EGFR结合，激活受体相关酪氨酸激酶的活性，引起细胞增殖，诱导产生转化表型等^［1］。胰腺癌中，TGFα而非EGF，往往与EGFR同时过表达，具有TGFα和EGFR过表达的胰腺癌表现出更强的侵袭性，患者存活时间缩短^［2］。

　　本室以往的研究观察到，表达反义EGFR的逆转录病毒载体对胰腺癌细胞系细胞生长的抑制作用明显强于反义EGF的作用^［3］，为研究EGFR另一配体TGFα在胰腺癌细胞生长及恶性表型维持中的作用，本实验构建了表达反义TGFα的逆转录病毒载体^［4］和反义EGFR的真核表达载体，单独或双重转染人胰腺癌细胞系PC-7细胞，观察它们对胰腺癌细胞生长的抑制作用和恶性表型的逆转作用。

　　1　材料和方法

　　质粒及细胞系　逆转录病毒载体pBabe-puro由英国帝国癌症研究基金Dr.Lemoine惠赠；表达载体pCMV-neo-Bam由美国Johns Hopkins Oncology Center Dr.Vogelstein惠赠；pGEM4Z质粒购自Promega公司；人胰腺癌细胞系PC-7为本室自建。

　　载体的构建　反义TGFα逆转录病毒载体及pGEM4Z-TGFα重组体的构建见文献［4］。含EGFRcDNA的pE7质粒，经BamHⅠ酶切得到1.024kb的EGFR cDNA片断，随机插入经BamHⅠ酶切及CIP去磷酸化的pCMV-neo-Bam载体，利用EGFR cDNA片断中不对称酶切位点PstⅠ酶切，鉴定出反向插入的反义EGFR表达载体，命名为pCMV-AS-EGFR。同时还构建了pGEM4Z-EGFR重组体，分别利用T7和SP6 RNA聚合酶，可体外转录合成正义及反义EGFR单链RNA探针。

　　双重转化细胞系的建立　表达反义TGFα逆转录病毒载体pBabe-AS-TGFα转化的PC-7细胞系PC-7/AS-TGFα的建立见文献［4］。用lipofectin转染方法，将重组体pCMV-AS-EGFR及pCMV空载体导入经反义TGFα转化的PC-7细胞中，经G418筛选，得到双重转化的PC-7细胞系，分别命名为PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR及PC-7/AS-TGFα/pCMV。

　　Northern blot和Southern blot分析^［5］　随机引物标记DNA探针进行Southern blot杂交，按Promega Riboprobe Gemini ⅡCore System试剂盒的说明进行体外转录合成单链RNA探针进行Northern blot杂交。

　　EGFR的¹²⁵I-EGF结合试验^［6］　胰酶消化收集细胞，对照管和实验管细胞数均为5×10⁵，于对照管中加10μl0.5μg/μlEGF，实验管中加10μlHepes缓冲液，各管加入3μl¹²⁵I-EGF2.778 kBq，终止反应后，于γ计数仪上测定实验管及对照管沉淀物¹²⁵I-EGF的放射性。

　　细胞生长的测定^［4］　细胞生长计数、软琼脂集落形成能力试验、³H-TdR掺入率测定、MTT法测定细胞增殖及代谢能力等方法分析细胞的生长。

　　转化细胞的凋亡检测^［7］　包括流式细胞术、DNA断裂的电泳鉴定、原位凋亡细胞检测及电镜观察。

　　2　结果

　　外源反义EGFR和内源性EGFR的表达　将反义EGFR的表达载体导入已经被反义TGFα转化的PC-7/AS-TGFα细胞，得到双重转化的细胞系PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR，其细胞总RNA经Northernblot后，利用pGEM4Z-EGFR重组体，经α-³²P标记SP6RNA聚合酶体外转录合成的反义EGFRRNA单链探针杂交，并用β-actin为探针杂交，结果经吸光度扫描分析，发现双重转化的PC-7/AS-TGFα／AS-EGFR细胞中内源性EGFR的表达明显受抑制，仅为对照组的24%(图1B)。用T7RNA聚合酶体外转录合成正义EGFR单链探针杂交，结果如图1C所示，可见在双重转染的PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR细胞中有约1kb大小的杂交带，说明双重转化的细胞系中有外源反义EGFR的存在和表达。

图1　Northern blot分析转化细胞中EGFR基因的表达

　　Fig 1　Northern blot analysis of the e xpression of EGFR in the transformed cells

　　A.loading control of RNA; B.using antisense EGFR single-strand RNA probe to det ect the inhibited expression of endogenous EGFR(Lane 1);C.using sense EGFR singl e-strand RNA probe to detect the expression of antisense EGFR (Lane 1);D.using the probe of β-actin; Lane 1:PC-7/AS-TGF α/AS-EGFR;Lane 2:PC-7/AS-TGF α ；Lane 3:PC-7

　　逆转录病毒载体的整合　转化细胞基因组DNA用XbalⅠ酶消化，以逆转录病毒载体puro cDNA片段为探针进行Southern blot杂交分析，PC-7/AS-TGFα，PC-7/AS-TGFα/pCMV,PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR组细胞中均可见1.5kb杂交带，证明双重转化的细胞中仍有逆转录病毒载体的整合(图2)。

图2　Southern blot分析转化细胞中逆转 录病毒载体的整合(以puro cDNA作探针)

　　Fig 2　Southern blot analysis of the r etroviral vector integration of the transformed cells with puro cDNA probe

　　Lane 1:PC-7；Lane 2:PC-7/AS-TGF α；Lane 3:PC-7/AS-TGF α/pCMV;Lane 4:PC-7 /AS-TGF α/AS-EGFR；the result showed that there were integrations of the retr oviral vectors in Lane 2～4

　　转化细胞表面EGFR的表达　¹²⁵I-EGF结合试验检测转化细胞EGFR的表达，结果表明，双重转化细胞表面受体-配体结合的放射性活度(A值)为24.9Bq，明显低于对照组细胞(A值86.7Bq)(t检验，P＜0.05)，表明双重转化的PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR细胞表面EGFR的表达下调。

　　双重转化细胞中cyclin D1癌基因的表达　Northern blot检测双重转化细胞中cyclin D1癌基因的表达，经吸光度扫描分析表明，PC-7/AS-TGFα及PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR细胞中cyclin D1的表达明显减弱，以双重转化细胞中cyclin D1的表达下调更明显，仅为对照组的21%(图3)。

图3　Northern blot 检测转化细胞中cyc lin D1的表达

　　Fig 3　Northern blot analysis of th e expression of cyclin D1 in the transformed cells

　　A.loading control of RNA;B.using cyclin D1 cDNA as probe;C.usi ng β-actin cDNA as probe; Lane 1:PC-7；Lane 2:PC-7/AS-TGF α；Lane 3:PC-7/ AS-TGF α/AS-EGFR;the result showed that the downregulation of the cyclin D1 e xpression in Lane 2,3

　　转化细胞生长速度的测定　结果表明双重转化细胞生长速度受抑制最明显，生长抑制率为71.3%。与反义TGFα单独作用相比，反义EGFR与TGFα联合作用使³H-TdR掺入率由25%下降至14.5%；MTT法检测细胞增殖及代谢能力表明，细胞生长受抑制更明显，生长抑制率由78.8%提高到86.0%。

　　软琼脂集落形成能力的测定　PC-7细胞软琼脂集落形成率为32.5%，单独用反义TGFα转化的PC-7细胞软琼脂集落形成率为1.03％～1.1%，双重转化PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR细胞无细胞集落形成。

　　细胞凋亡的检测　流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳转化细胞的凋亡检测表明，转化细胞大部分阻滞于G₁期(附表)，而PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR细胞在去血清培养基中培养24h出现了亚G₁峰及DNA Ladder，培养约48h后，PC-7/AS-TGFα细胞出现了凋亡细胞峰，而对照组PC-7及空载体转化的细胞则未见明显的凋亡细胞峰。原位细胞凋亡检测发现，PC-7/AS-TGFα及PC-7/AS-TGFα/AS-EGFR两组细胞均可见较多凋亡细胞，荧光显微镜下观察，可见呈绿色荧光的凋亡细胞，而非凋亡细胞呈桔红色荧光。电镜观察凋亡细胞染色质凝集于核膜下，并形成凋亡小体(图4)。

图4　电镜观察凋亡细胞

　　Fig 4　The detection of the apoptot ic cells by electron microscope

　　A.the chromatin of a apoptotic cell was aggregated unde r the membrane of the

　　nuclear　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　×17000

　　B.there were apoptotic bodies formation　　　　　　×15000

附表　转化PC-7细胞的细胞周期分析

　　Table　Cell cycle analysis of the transformed cells

　　3　讨论

　　TGFα、EGF及其共同的受体EGFR所形成的自分泌环的异常，在胰腺肿瘤发生、发展中占有重要的地位^［8］。本室以往的研究表明，反义EGF对人胰腺癌细胞系细胞生长的抑制作用，不如反义EGFR强^［3］。本研究的前期工作构建了表达反义TGFα的重组逆转录病毒载体，并成功地转染到人胰腺癌细胞系PC-7中，用反义TGFαRNA阻断TGFα的表达，在体内外能有效地使人胰腺癌细胞系恶性表型部分逆转^［4］。

　　尽管单独阻断TGFα/EGFR自泌环中的配体或受体均能明显地抑制胰腺癌细胞的增殖，但不能完全抑制肿瘤的生长及消除其恶性表型。本实验将反义EGFR的表达载体导入已由反义TGFα转化的胰腺癌PC-7细胞，观察同时抑制TGFα及EGFR的作用。结果双重转化细胞内源性TGFα和EGFR mRNA表达下调，¹²⁵I-EGF结合力检测表明，细胞表面EGFR受体表达下降。反义EGFR与反义TGFα联合作用与反义TGFα单独作用相比，细胞增殖及代谢能力受抑制更明显，软琼脂集落形成能力丧失，更加有效地逆转了肿瘤细胞的恶性表型。表明双重反义抑制的方法可行而且有效。

　　生长因子、细胞因子、激素及癌基因产物等对DNA代谢的调节是通过细胞周期实现的，许多基因的表达又受细胞周期制约，cyclin D1为G₁期重要的周期蛋白，作为生长因子的感受器(growth factor sensor)，通过传导生长因子信号刺激，引起一系列级联调控，调节细胞周期中G₁-S的限制点，从而调节细胞周期的进程^［9］。本结果显示，反义TGFα及联合反义EGFR均能使cyclin D1的表达下调，经双重反义抑制后下调更明显。文献资料表明，从巨噬细胞中撤去集落刺激因子CSF时，cyclin D1水平迅速下降^［10］；原代培养的肝细胞中，外源性TGFα的刺激使cyclin D1 mRNA水平明显增高^［11］；另外还有一些生长因子如PDGF转化细胞对cyclin D1表达具有明显诱导作用^［12］。本实验用流式细胞术分析经反义TGFα、反义EGFR转化细胞的细胞周期发现，转化细胞大部分被阻滞于G₁期，推测其可能与cyclin D1表达下调有关。cyclin D1表达下降，使细胞不能通过G₁-S期限制点而停滞于G₁期，从而抑制细胞生长。

　　对转化细胞的凋亡分析发现，反义TGFα以及联合反义EGFR均可导致较明显的细胞凋亡发生，而且联合抑制作用使细胞更容易发生凋亡。肿瘤细胞的生长和恶性表型的维持与细胞内凋亡调节的紊乱有着密切的关系，Raff^［13］等认为细胞的自然凋亡过程往往被包括生长因子及其受体在内的抑制物所控制，生长因子一方面刺激细胞增殖，另一方面又抑制凋亡的发生。然而目前关于生长因子对凋亡的特异调节机制了解不多。有报道在一种脂质介导的肝细胞瘤HuH-7细胞的凋亡过程中，TGFα的表达明显下调，而且进一步只用抗TGFα抗体或抗EGFR的抗体分别作用，均能引起凋亡的发生^［14］。抗EGFR抗体能有效地抑制人结肠癌细胞系DiFi的增殖，细胞被阻滞于G₁期，进而发生凋亡^［15］，与本实验观察反义TGFα及反义EGFR抑制并发生凋亡的结果一致。

　　作者单位：中国医学科学院　中国协和医科大学　协和医院病理科，北京　100730

　　参考文献

　　[1]Salomon DS,Kim, N,Saeti T, et al. Transforming growth facto r-α:an oncodevelopmental growth factor. Cancer Cells, 1990,2:389～397

　　[2]Yamanaka Y,Friess H, Kobrin MS,et al. Coexpression of epithelial gr owth factor receptor and ligands in human pancreatic cancer is associated with e nhanced tumor aggressiveness. Anticancer Res,1993,13:565～569

　　[3]Liu TH,Chen J,Zeng CX.Effects of antisense EGF and its receptor retrovi ral expression vector on cell growth of human pancreatic carcinoma cell line.Chi nese Med J,1995,108:653～659

　　[4]Xu Y,Liu TH,Gao J.Influence of recombinant retroviral vector expressing antisense TGF α on malignant phenotype of human pancreatic carcinoma cell line . Chinese Med J,1998,111:334～338

　　[5]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T,et al. Molecular cloning: a labo ra tory manual. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988,343～371

　　[6]Huang S, Turjillo J, Chakrebruty S. Proliferation of human colon cancer cells:role of epidermal growth factor and transforming growth factor α.Int J C ancer, 1992,52:978～986

　　[7]姜泊，张亚历，周殿元，等.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.170～180

　　[8]Korc M, Chandrasekar B, Yamanaka Y,et al. Overexpression of epiderm al growth factor receptor in human pancreatic cancer is associated with concomit ant increases in levels of epidermal growth factor and transforming growth facto r alpha.J Clin Invest,1992,90:1352～1360

　　[9]Sherr CJ.Mammalian G₁ cyclins. Cell, 1993,73:1059～1069

　　[10]Matsushime H,Roussel MF,Ashmun RA, et al.Colony-stimulation factor 1 re gulates novel cyclins during the G₁ phase of the cell cycle. Cell,1991,65:701 ～713

　　[11]Koch DS, Lu XP,Leffert HL, et al. Primary rat hepatocytes express cyclin D1 mRNA during their growth cycle and during mitogenic transitions induced by t ransforming growth factor-α.Biochem Biophysi Res Commun,1994,204:91～97

　　[12]Winston JT,Pledger WJ.Growth factor regulation of cyclin D1 mRNA expression through protein synthesis-dependent and-independent mechanisms. Mol Biol Cell, 1993,4:1133～1144

　　[13]Raff MC,Barres BA,Burne JF,et al. Programmed cell death and control of cell survival:lessons from the nervous system. Science, 1993,262:695～700

　　[14]Nakamura N, Shidoji Y,Moriwaki H. Apoptosis in human hepatoma cell line indu ced by 4,5-pidehydro geranylgeranoic acid via down-regulation of transforming growth factor α.Biochem Biophysic Res Commun,1996,219:100～104