p16、CyclinD1、Cdk4、Rb基因在胰腺癌中的表达及其意义

癌症 1999年第4期第18卷 基础研究

作者：何劲松　赖焕辉　姜立华　吕新生　曹亚　卓缨　黄幸青　王江桥

单位：何劲松　赖焕辉　姜立华　黄幸青　王江桥　广东省粤北人民医院普外科(韶关,512026)；吕新生　湖南医科大学湘雅医院普外科(长沙,410078)；曹亚　卓缨　湖南医科大学肿瘤研究所(长沙,410078)

关键词：胰腺肿瘤；基因；免疫组化；原位杂交

　　【摘要】目的：探讨p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb在胰腺癌中的作用及其相互关系。方法：免疫组织化学检测p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb蛋白在胰腺癌中的表达，原位杂交检测p16和CyclinD₁在胰腺癌中的存在状况。结果：p16在胰腺癌中低表达，CyclinD₁和Cdk4过度表达，未发现Rb在胰腺癌标本中缺失；p16与CyclinD₁，p16与Rb呈负相关关系（P＜0.05），Cdk4与Cyclin d₁呈正相关关系（P＜0.05）。结论：胰腺癌发生机制涉及p16、Cyclin d₁、Cdk4和Rb调节环路中多个基因的异常，p16低表达和Cyclin d₁过度表达可能起在胰腺癌发生中起协同作用。

　　中图分类号：R735.9　　文献标码识：A　　文章编号：1000－467X(1999)04－0418－04

The expressions of p16, cyclin D₁,Cdk4,Rb, and their significance in pancreatic carcinoma

HE Jin－song, LAI Huan－hui, jIANG Li－hua, et al.

　　【Abstract】Objectives：To study the mechanism of p16, CyclinD₁, Cdk4, Rb, and their relationship in pancreatic carcinoma.Methods：To examine these proteins and genes by immunchistochemistry and in situ hybridization.Results：Overexpression of cyclin D₁ and Cdk4 were revealed in these samples and p16 was undetectable, the Rb deletion was not revealed in these samples. There is a negative relationship between p16 and cyclin D₁,p16 and Rb in these samples (P＜0.05); there is a positive relationship between cyclin D₁ and Cdk4 (P＜0.05).Conclusions：Abnormality of many genes involved in the regulatory pathway of p16,cyclin D₁/Cdk4 and Rb may be involved in the molecular mechanism of pancreatic carcinogenesis, both the lower pression of p16 and the overexpression of cyclin D₁ may coexist in the development of pancreatic carcinoma.

　　Key words：Pancreatic carcinoma;Gene;Immunohistochemistry;In situ hybridization

　　细胞的正常生长依赖于细胞周期中各种调节因子的平衡调控，其中包括细胞周期素D₁（Cyclin d₁）对细胞生长的正性调控及周期素依赖性激酶（Cdk4）抑制子（p16）对细胞生长的负性调控。调控环路中任一调节因子发生紊乱都将导致细胞增殖异常，诱发肿瘤^[1，2]。p16是新近分离出来的抑癌基因，p16功能丧失或CyclinD₁过度表达都会导致Cdk4对视网膜母细胞瘤易感因子(Rb)的调节障碍，使Rb处于持续磷酸化状态，释放大量生长调节因子E2F，细胞过度增殖诱发肿瘤^[3]。胰腺癌的发病机制中是否也存在上述癌基因和抑癌基因的功能紊乱，其具体调节机制如何，尚缺乏进一步的研究，为检测p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb在胰腺癌中的改变情况，探索其相互关系及与胰腺癌发生的关系，我们用免疫组织化学及cDNA－mRNA原位杂交技术，对34例原发性胰腺癌进行了研究分析。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本

　　34例胰腺癌组织取自我院和湘雅医院病理科1996年9月～1998年4月的手术切除标本，均为腺癌，其中高分化20例，中分化4例，低分化10例，伴有淋巴结转移的30例，无淋巴结转移的4例。另取6例良性胰腺病变组织作为对照。标本均经4％的中性多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片。

　　1.2　抗体和探针

　　兔抗人p16（N－20），CyclinD₁（H－295），RB（C－15）多克隆抗体和羊抗人Cdk4（C－22）多克隆抗体均购自美国SantaCruz生物技术公司。p16和CyclinD₁cDNA质粒片断均由湖南医科大学肿瘤研究所提供(源自美国南加洲大学病理系周见远博士)。探针均经酶切鉴定，随机引物法地高辛标记。探针标记、原位杂交、免疫组化SP试剂盒分别购自德国BoehringerMannheim生物技术公司和福洲迈新生物技术公司。

　　1.3　免疫组化染色

　　常规SP免疫组化染色法。CyclinD₁，Rb经微波抗原修复（温度95℃，时间两个5分钟）。P16，CyclinD₁，Cdk4，Rb抗体的免疫产物均用过氧化物酶－DAB显色，抗体效价分别为1∶40，1∶50，1∶50，1∶100。免疫组化阴性对照采用一抗为PBS替代，阳性对照为试剂盒提供的人宫颈癌及乳腺癌阳性对照片。

　　染色结果判定标准：参照Fromowitz方法^[4]，在高倍镜下对细胞核内反应如下评分：（1）无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；（2）阳性范围：＜5％为0，5％～25％为1，26％～50％为2，51％～75％为3，＞75％为4。两项结果相加＜2为阴性（－），2～3为弱阳性（＋），4～5为中度阳性（＋＋），6～7为强阳性（＋＋＋）。

　　1.4　原位杂交

　　全部标本都行p16及CyclinD₁cDNA－mRNA原位杂交检测，按《分子克隆实验指南》常规原位杂交检测方法，探针浓度为400～500ng/ml。杂交信号检测由试剂盒提供的碱性磷酸酶—BCIP/NBT法显色，阳性信号以胞核内清晰可见的紫兰色团块判断。原位杂交阳性对照片由试剂盒提供，省略探针步骤为阴性对照。

　　1.5　统计学分析

　　两两间比较采用χ²检验，所有数据统计均在Stata软件上进行。

　　2　结果

　　2.1　免疫组化

　　结果判断均以核内染色为阳性信号，6例胰腺良性病变组织中分别可见部分腺管细胞呈现四种基因的弱阳性（＋）蛋白表达。

　　2.1.1　p16的表达：34例胰腺癌组织中10例过度表达（＋＋～＋＋＋），占29％；8例弱阳性（＋），占24％；16例阴性（－），占47％，阴性病例中部分组织的相对正常腺体细胞可见p16弱阳性表达。

　　2.1.2　CyclinD₁的表达：18例呈现过度表达（＋＋～＋＋＋），占53％，表达增高的细胞仅限于肿瘤细胞（图1）；12例低表达（＋），占35％；2例未见阳性表达（－），占5％。其中14例p16阴性或弱阳性表达的肿瘤，CyclinD₁均呈强阳性表达；6例CyclinD₁弱阳性表达的肿瘤，p16呈过度表达；两例p16和CyclinD₁均呈阴性；2例p16阴性的肿瘤CyclinD₁弱阳性；10例均对应地呈强弱不等的阳性表达。

　　2.1.3　Cdk4的表达：20例呈现过度表达（＋＋～＋＋＋），占59％（图2）；8例低表达（＋），占24％；6例未见阳性表达（－），占17％。

　　2.1.4　Rb的表达：全部病例呈现强弱不等的阳性表达（图3）；其中22例p16表达阴性或弱阳性的肿瘤，Rb均呈现中度阳性或强阳性（＋＋～＋＋＋），而6例Rb表达弱阳性的肿瘤，p16表达均呈现中度阳性或强阳性（＋＋～＋＋＋）；另4例p16和Rb均呈现中度阳性或强阳性（＋＋～＋＋＋）。

　　2.1.5　p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb的相关性、与胰腺癌分化、淋巴结转移的关系：结果表明p16与CyclinD₁，p16与Rb呈负相关关系（P＜0.05）;Cdk4与CyclinD₁呈正相关关系（P＜0.05）;未发现p16与Cdk4,CyclinD₁与Rb,Cdk4与Rb有明显相关性（P＞0.05）。不同分化程度的胰腺癌组织中p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb蛋白表达程度不同，但相关分析无显著性差异（P＞0.05）；本文未发现p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb蛋白表达与胰腺癌淋巴结转移有明显关系（P＞0.05），见表1，表2。

表1　p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb蛋白表达的相关性

　　注：P＜0.05有显著性意义

表2　p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb表达与胰腺癌分化、淋巴转移的关系

　　注：P＞0.05无显著性意义2.2　p16，CyclinD₁的cDNA－mRNA原位杂交

　　mRNA呈紫蓝色颗粒状存在于胞核和/或胞浆中，所有免疫组化p16表达阳性的标本其对应的cDNA－mRNA原位杂交亦呈现阳性，二者阳性细胞数量和分布基本一致；两例免疫组化p16表达阴性的标本其对应的cDNA－mRNA原位杂交却呈现阳性。所有CyclinD₁的免疫组化和原位杂交检测结果基本一致（图4、5）。

图1　胰腺癌CyclinD₁蛋白胞核强阳性(免疫组化SP法×400)；

　　图2　胰腺癌Cdk4蛋白胞核强阳性(免疫组化SP法×400)；

　　图3　胰腺癌Rb蛋白胞核弱阳性(免疫组化SP法×400)

　　图4　胰腺癌p16cDNA－mRNA原位杂交胞核阴性(×400)；

　　图5　胰腺癌CyclinD₁cDNA－mRNA原位杂交胞核阳性(×400)

　　3　讨论

　　本文研究结果表明，47％的胰腺癌标本中没有检测到p16蛋白，提示胰腺癌中存在p16基因的丢失或突变，p16的失活在胰腺癌的发生中占有重要地位，与前人报道相吻合^[5]；CyclinD₁过度表达和p16低表达同时存在于41.2％的胰腺癌中，相关分析（P＜0.05）显示二者之间呈负相关,表明胰腺癌中p16和CyclinD₁异常可同时存在并呈反馈调节参与肿瘤的发生。Cdk4与CyclinD₁呈正相关（P＜0.05）参与肿瘤发生，与Khatib报道一致^[6],但Cdk4改变与p16异常无明显关系（P＞0.05），提示胰腺癌中CyclinD₁与Cdk4结合的生物学活性强于p16，Cdk4是潜在的癌基因。所有标本中均检测到了Rb蛋白的表达，提示Rb的缺失或突变在胰腺癌发生中不占主要地位，与Chung等报道一致^[7]，Rb与p16的相关性分析（P＜0.05）表明两者之间呈明显的负相关，与人们在肺癌或膀胱癌细胞系中所检测到的结果一致^[8,9]。本文结果不仅为p16、CyclinD₁、Cdk4、Rb在调节细胞周期活动中构成反馈调节通路的推论提供了依据^[10]，而且也证实了这一生长抑制通路在胰腺癌中是一常见现象，表明p16丢失，CyclinD₁和Cdk4的过度表达通过共同的Rb途径参与胰腺癌的发生，胰腺癌的分子发生机制中涉及调节通路中多个基因的异常；p16低表达和CyclinD₁过度表达可能在胰腺癌的发生中起协同作用。

　　我们没有发现p16，CyclinD₁，Cdk4和Rb异常与肿瘤分化的关系，可能与样本例数少有关，但同一类型的胰腺癌存在不同的基因改变，肿瘤内具有不同的细胞亚群，其生物学性状可能不同^[11]。本研究未发现p16,CyclinD₁,Cdk4和Rb与淋巴转移的关系，可能与临床所取标本大部分为晚期胰腺癌有关，因此，提高胰腺癌的早期诊断水平对胰腺癌基因水平的深入研究有重要意义。

　　cDNA－mRNA原位杂交结果表明并非所有p16表达阴性均为该基因缺失所致，可能的解释是p16的表达受转录后机制的调节，部分还因为Rb的反馈抑制效应所致^[8]，p16基因的失活性点突变使p16不表达也是因素之一^[8,11]。对于p16高表达而CyclinD₁低表达的胰腺癌，是CyclinD₁的生物学效应比p16强的原因。虽然Rb在胰腺中均表达，但其可能是以磷酸化形式存在或因其突变致功能性失活不能发挥抑癌作用，要弄清其机制，最好进一步进行其突变、缺失和磷酸与非磷酸化检测。本文研究表明p16、CyclinD₁/Cdk4和Rb环路在胰腺癌发生中占有重要地位,进一步了解其在细胞周期中的反馈机制,设法调节抑癌基因p16,Rb和癌基因CyclinD₁,Cdk4之间的平衡关系,对今后肿瘤的基因治疗有极其重要的价值。

　　参考文献

　　1　Hunter T , Pines J. Cyclins and Cancer II：Cyclin d and CDK inhibitors come of age [J] .Cell,1994,79：573～582.

　　2　Kamb A. Cell－cycle regulators and cancer [J] .Trends Genet,1995,11：136～140.

　　3　Chellappan SP, Hiebert S,Mudryi Me, et al. The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein [J] . Cell,1991,65：1053～1061.

　　4　Fromowitz FB,Voila MV,Chao S,et al. Ras p21 expression in the progression of breast cancer [J] .Human pathol， 1987,18：1268～1275.

　　5　Bartsch D ,Shevlin DW,Tung WS ,et al. Freqent mutation of CDKN2 in primary pancreatic adenocarcinomas [J] . Genes Chromosomes Cancer ,1995,14(3)：189～195.

　　6　Khatib ZA, Matsushime H， Valentine M,et al. Coamplification of the CDK4 gene with MDM2 and GLI in human sarcomas [J] . Cancer Res,1993,53：5535～5541.

　　7　Chung DC,Smith AP,Louis DN,et al. Analysis of the retinoblastoma tumour suppressor gene in pancreatic endocrime tumours [J] . Clin Endocrinol (Oxf),1997,47(5)：523～528.

　　8　Shapiro GI,Edwards CD,Kobzik L,et al.Reciprocal Rb inactivation and p16INK4 expression in primary lung cancers and cell lines [J] .Cancer Res,1995,55：505～509.

　　9　Yeager T,Stadler W,Belair C,et al.Increased p16 levels correlate with pRb alterations in human urothelial cells [J] . Cancer Res,1995,55：493～497.

　　10　Serrano M,Hanon GJ,Beach DA. A new regulatory motif in cell－cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4 [J] .Nuture,1993,366：704～707.

　　11　Lukas J,Parry D,Aagaard L,et al. Retinoblastoma－pyotein－dependent cell－cycle inhibition by the tumor suppressor p16 [J] .Nuture ,1995,375：503～506.

收稿日期：1998－10－20；修回日期：1998－12－28