K-ras基因在胰腺癌中的研究进展

江苏医药 2000年第1期第26卷 综述

作者：戴存才　刘训良　杜竞辉

单位：戴存才（210029　南京医科大学第一附属医院普外科）； 刘训良（210029　南京医科大学第一附属医院普外科）； 杜竞辉（210029　南京医科大学第一附属医院普外科）

　　胰腺癌K-ras基因点突变率高达67～100％^［1～15］，突变几乎总是发生在第12位密码子上，突变方式也几乎皆为CGT、GTT及GAT，而正常胰腺组织、急慢性胰腺炎、胰岛素瘤、胰腺良性囊肿及胰腺其他疾病均无K-ras基因突变。因此，检测K-ras基因第12位密码子有无突变，有助于临床判断胰腺肿块的良恶性及胰腺癌的诊断。本文就近十年来的研究进展及方法作一综述。

　　一、PCR-RMCM研究

　　PCR-RMCM（RNAase A mismatch cleavage method，RNA酶不配对分裂法）：采用K-ras基因的特异引物，经PCR扩增，产物用放射性同位素（如³²P）标记的RNA探针杂交，再用RNAaseA消化，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射性自显影观察结果。方法不足之处是不能确切知道K-ras基因点突变方式。

　　1988年Almoguera等^［1］采用此法对22例胰腺癌组织标本检测，其中21例（95.45％）存在K-ras基因点突变，而相应病例正常部位胰腺组织和5例胆囊癌均未见该基因突变，在7例有转移的病例中，K-ras基因突变同时存在于胰腺原发灶和转移灶。1990年Shibata等^［2］对胰腺肿块细针穿刺物检测发现：在穿刺细胞学诊断为胰腺癌的25例中，有18例（72％）存在K-ras基因突变，所有7例良性胰腺病变和4例胰腺区域非胰腺癌的肿瘤（淋巴瘤、肉瘤、胃癌及胆管癌）均未见其突变，并指出临床对胰腺肿块病人，将穿刺细胞学与PCR-RMCM检测相结合，可以作出更确切的诊断。作者在分析其点突变率低于其他学者的原因时，认为标本中含突变K-ras基因的肿瘤细胞分布不均匀性和数量多少是影响突变率检出的重要因素。

　　二、PCR-ASOH研究

　　PCR-ASOH（Allele-specific oligonucleotide hybridization，特异等位基因寡聚核苷酸探针杂交）：采用K-ras基因的特异引物，经PCR扩增，产物转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，与多个放射性同位素标记、人工合成的寡聚核苷酸探针杂交，放射性自显影观察结果，可以分辨出几乎所有位点的K-ras基因点突变。

　　1988年Smit等^［3］采用此法对30例胰腺癌组织标本检测，其中28例（93.3％）存在K-ras基因突变，其突变方式与肺癌K-ras基因突变方式相似，与结肠癌K-ras基因突变方式不同，认为吸烟是诱发K-ras基因突变的重要因素，不同的化学物质可导致K-ras基因不同的突变方式，并指出标本中肿瘤细胞在10％～20％以上即可检出K-ras基因突变。1991年Motojma等^［4］对105例胰腺及其周围病变组织标本检测，胰腺癌K-ras基因点突变率为88.6％（39／44），指出有时巨大胰头附近肿瘤，即使显微镜下亦难以区别为胰腺癌或其他壶腹周围癌，此时检测K-ras基因第12位密码子有无突变点，可以有助于鉴别胰腺癌与其他壶腹周围癌，可以作为诊断胰腺癌的一种方法应用于临床。1993年Motojima等^［5］再次对53例胰腺癌石蜡包埋组织标本检测，46例（86.8％）存在K-ras基因点突变，文中指出过去有认为胰腺癌多中心率达15％～40％，通过对K-ras基因突变的检测，作者认为多中心胰腺癌率仅6％左右，临床没有必要为防止肿瘤复发而行全胰切除术。Schaeffer等^［6］在1994年报道对8例小胰腺癌（直径1.2cm～3cm）标本检测，其中6例（75％)存在K-ras基因第12位密码子点突变，作者指出早期胰腺癌和晚期胰腺癌一样均存在较高的K-ras基因点突变，认为在胰腺癌的起源中有重要作用。

　　三、PCR-SSCP研究

　　PCR-SSCP（Single strand conformation polymorphism，单链构象多态性）：根据单链DNA碱基序列不同，所形成的空间构象不同，因而泳动速度不同，在电泳时可迁移分开。方法：利用K-ras基因的特异引物，PCR扩增包含发生单个碱基突变及其两侧的DNA片段，变性成单链DNA后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，通过放射性或非放射性（银染、溴乙锭染色或荧光标记）显影观察结果。该法从理论上讲可以检测任何位点上的单个碱基突变，但在实际应用中可能会有相当比例的假阴性结果，且不能确定K-ras基因突变方式。

　　Kondo等^［7］对胰液标本检测，其中9例胰腺癌中有6例（67％）存在K-ras基因突变，而14例健康者、10例慢性胰腺炎及3例胰岛细胞瘤的胰液均未见K-ras基因突变。同时9例胰腺癌胰液细胞学检查皆为阴性。作者指出检测胰液中K-ras基因有无突变，有助于胰腺癌的诊断。

　　四、PCR-RELP研究

　　PCR-RELP（Restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）：是在引物中设计替代碱基，建立正常和突变的K-ras基因中不同的核酸内切酶位点，PCR扩增产物经特异的核酸内切酶水解，形成大小不同的DNA片段，经电泳染色后观察结果。其不足之处与RMCM、SSCP一样，不能确定K-ras基因突变方式，等长的酶切片段难以区别。

　　1993年Urban等^［8］对12例胰腺癌细针穿刺标本检测，其中11例（92％）存在K-ras基因突变，并发现1例胰腺癌腹水中也存在K-ras基因突变，作者指出PCR-RFLP是一种快速、简便、敏感和具有诊断实用性的方法，与病理细胞学检查相结合，可以提高胰腺癌确诊率。同年Hruban等^［9］对82例胰腺癌石蜡标本检测，其中68例（83％）存在K-ras基因突变，并被PCR-ASOH法证实。

　　五、PCR-DSM研究

　　PCR-DSM（Direct sequencing method，DNA序列直接测定）：目前主要是采用改进的Sanger双脱氧末端终止法测序，其基本原理：以PCR扩增产物的单链DNA为模板，加入引物及4种dNTP，其中一种dNTP含³²P或³⁵S标记，另外再加入一定比例的2′，3′双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP），在DNA聚合酶催化合成过程中，遇到应该dNTP参入的位置就有两种可能情况发生，如正常底物dNTP参入，则链可以继续延伸；如果是ddNTP参入，合成反应就此终止。因为ddNTP的3′位置没有自由羟基，不能再与下一个dNTP形成3′-5′磷酸二酯健，因此可以得到一系列不同长度的ddA、ddG、ddT和ddC为结尾的片段，经过能够分辨相差一个核苷酸长度的聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射性自显影后，即可在X光片上直接读出碱基序列。该法能精确分析基因结构，但操作太繁杂，仪器昂贵，临床上不易普及推广。

　　1990年Tada等^［10］对18例胰腺癌石蜡标本检测，发现均存在K-ras基因第12位密码子点突变，突变率达100％。其余11例胆管癌、9例胆囊癌及2例胰岛细胞瘤均无K-ras基因突变。次年Tada等^［11］又在上述报道的基础上，对19例胰腺肿块活检及穿刺标本检测，其中12例存在K-ras基因第12位密码子点突变，均被术后病理证实为胰腺癌，诊断符合率达100％，而6例慢性胰腺炎及1例腹膜后肿瘤（嗜铬细胞瘤）均未见K-ras基因突变。作者指出K-ras基因突变形式的不同，与引起胰腺癌的致病因素不同有关，检测K-ras基因有无突变，有助于确诊有争议的胰腺癌，与病理细胞学检查相结合，可提高胰腺癌的诊断率。

　　六、PCR-SSP研究

　　PCR-SSP（Sequence special primers，顺序特异性引物）：是根据K-ras基因第12密码子点突变方式（CGT、GTT及GAT）设计引物，有意义引物的3′末端碱基分别对应野生型GGT中第一个G突变为C，第二个G突变为T及A，通过PCR扩增，产物借助常规电泳、染色即可知有无K-ras基因突变及突变方式。与前述五种方法比较，PCR-SSP具有四大优点：（1）特异、敏感：在PCR最优化条件下，每对引物仅对有相应突变方式的模板进行扩增，提高退火温度又加强了这种特异性。（2）无需酶切、杂交、放射性及非放射性显影技术。（3）简捷快速而准确地结果判断：PCR扩增后的处理过程十分简捷，仅根据是否存在特异产物的阳性条带而定，从样品处理到结果报告只需数小时。而前述五种方法PCR扩增后处理过程复杂，耗时长，从样品处理到结果报告至少需24-72小时。（4）临床易普及应用。

　　1993年Tada等^［12］采用此法对收集的10例胰液检测，其中6例胰腺癌及1例导管内乳头状肿瘤均存在K-ras基因第12位密码子点突变，而1例胆石症及2例慢性胰腺炎均无K-ras基因突变。同时又对6例胰腺癌病人外周血检测，其中2例存在该密码子点突变。我们自1994年以来，先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、胰腺肿块细针穿刺组织及胰液标本检测，K-ras基因第12位密码子点突变率分别为74.2％（23／31）^［13］，95.1％（39／41）^［14］，91.4％（32／35）^［15］及94.1％（16／17），无假阳性发生，我们认为该法简便、快速、特异、敏感，对胰腺肿块术前定性诊断具有重要参考价值，有助于胰腺癌的早期诊断。不足之处是每个标本需做3个PCR反应体系，对其他偶发突变（AGT、TGT、GCT等）存在漏检。■

　　参考文献：

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　　［3］Smit VTHBM，Boot AJM et al．K-ras codon 12 umtations occur very frequently in pancreatic adenocarcinomas．Nucleic Acids Research，1988；16：7773-7782．

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　　［7］Kondo H，Sugano K，Fukayama N，et al．Detection of point mutations in the K-ras oncogene at codon 12 in pure pancreatic juice for diagnosis of pancreatic carcinoma．Cancer，1994，73（6）：1589-1594．

　　［8］Urban T，Ricci S，Grange JD，et al．Detection of c-Ki-ras mutation by PCR／RFLP analysis and diagnosis of pancreatic adenocarcinomas．J Natl cancer Inst，1993，85（24）：2008-2012．

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　　［11］Tada M，Omata M and Ohto M．Clinical application of ras gene mutation for diagnosis of pancreatic adenocarcinoma．Gastroenterology， 1991，100：233-238．

　　［12］Tada M，Omata M，Kawai S，et al．Detection of ras gene mutation in pancreatic juice and peripheral blood of patients with pancreatic adenocarcinoma．Cancer Res，1993；53：2472-2474．

　　［13］戴存才，刘训良，苗毅，等．PCR-SSP快速检测胰腺癌石蜡切片中K-ras基因点突变．南京医科大学学报，1996，16（4）：330-333．

　　［14］刘训良，戴存才，杜竞辉，等．PCR-SSP快速检测胰腺癌K-ras基因第12位密码子点突变．中华实验外科杂志，1997；14（2）：126-127

　　［15］戴存才，刘训良，杜竞辉，等．多聚酶链反应顺序特异性引物诊断胰腺癌．中华外科杂志，1997；35（3）：172．