组织因子、凝血酶受体和血栓调节蛋白在胰腺癌细胞中的表达
中华实验外科杂志 2000年第2期第17卷 胰腺肿瘤
作者：成军 朱国静 丁义涛 陈易人
单位：成军 朱国静 丁义涛(210008 南京大学医学院附属鼓楼医院外科)；(苏州医学院附属第一医院外科)陈易人
关键词： 细胞，癌，胰腺；组织因子；凝血酶受体；血栓调节蛋白
【摘要】 目的 研究组织因子(TF)、凝血酶受体(TR)和血栓调节蛋白(TM)在胰腺癌细胞中的表达。方法 采用细胞培养、免疫细胞化学和Northern印迹分析方法。结果 每个抗原都在细胞膜及(或)细胞浆中有特征性的免疫反应，TF和TR主要在细胞浆，TM在细胞膜。TR表达越多，TM表达越少。TR mRNA在野生型胰腺癌细胞株中表达，凝血酶和水蛭素均降低TRmRNA的表达量。凝血酶可致人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2和Panc-1 DNA合成增加(P＜0.05)，在凝血酶刺激0.5和6h时达高峰。结论 胰腺癌细胞的TF、TR和TM表达参与了胰腺癌的血液高凝状态。
Expression of thrombin receptor with tissue factor and thrombomodulin in human pancreatic cancer cells
CHENG Jun, ZHU Guojing, DING Yitao, et al.
(Department of Surgery, The Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical College, Nanjing 210008, China)
【Abstract】 Objective To study the expression of tissue factor (TF), thrombin receptor (TR) and thrombomodulin (TM) in human pancreatic cancer cells.Methods Human pancreatic carcinoma cell lines (n=4) were studied by using cell culture, immunocytochemistry and Northern blotting analysis.Results Both TF and TR were predominantly cytoplasmic in distribution, TM was membrane localized. The higher TR expression, the lower TM expression. TRmRNA was expressed in 4 pancreatic cancer cell lines (CaPan-2, MiaPaCa-2, Panc-1 and BxPC-3). Thrombin and hirudin decreased the TRmRNA expression. Thrombin treatment increased DNA synthesis of MiaPaCa-2 and Panc-1 cells.Conclusion The expression of TF, TR and TM might take part in the pathogenesis of hypercoagulable state in pancreatic cancer.
【Key words】 Cell, cancer, pancreatic; Tissue factor; Thrombin receptor; Thrombomodulin
胰腺癌有较高的弥漫性血管内凝血和血栓性并发症的发病率。我们采用细胞培养、免疫细胞化学、Northern印迹分析等，研究组织因子(TF)、凝血酶受体(TR)和血栓调节蛋白(TM)在人胰腺癌细胞中的表达，探讨凝血酶和水蛭素对胰腺癌细胞DNA合成的影响。材料和方法
1. 细胞培养：人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2、Panc-1、BxPC-3和CaPan-2常规用RPMI 1640含体积分数为10%小牛血清(FCS，Gibco)及1% L-谷氨酰胺和1%青、链霉素培养，维持在37℃含体积分数为95% O2和5% CO2的湿培养箱内。细胞贴壁形成单层后，用胰蛋白酶-EDTA(Gibco)贴壁，再用磷酸盐缓冲溶液(PBS液)洗。
2. 免疫细胞化学检测：肿瘤细胞(3×104个)在玻片上生长过夜，细胞贴于玻片，PBS淋洗，室温干燥后将玻片-20℃保存至免疫染色。丙酮固定，浸于含体积分数为0.3%过氧化氢(H2O2)甲醇中。检测抗原的抗体有：(1)TF：TF多克隆抗体(伦敦血栓研究所，TRI)为兔抗人TF抗体；(2)TR：TR单克隆抗体(剑桥大学)为兔抗人TR抗体；(3)TM：TM单克隆抗体(Dako)，为鼠抗人TM抗体。取60μl抗体(1∶50稀释)滴于玻片上，室温孵育1.5h，加猪抗兔或兔抗鼠IgG(Dako)再孵育1.0h(1∶300稀释)；PBS洗后再加ABC复合物(Dako，10mg/L抗生物素蛋白+2.5mg/L生物素-过氧化物酶)孵育45min；随后3，3′-二氨基联胺(DAB)和体积分数为0.03% H2O2进行颜色反应，再苏木素复染。阴性对照，PBS代替第一抗体。染色密度半定量计算：-，无染色；+，轻度染色；，中度染色；，强染色。
3. Northern印迹分析：以3.8kb TRcDNA作为TR探针(剑桥大学)(α-32P)-dATP标记。细胞总RNA样本取自4种野生型(WT)胰腺癌细胞株，或凝血酶(1×103U/L)和水蛭素(1×103U/L)处理细胞。其中用RNA溶解液［150mmol/L NaCl, 10mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris), pH 7.4, 1mmol/L MgCl2，体积分数为0.5%辛基酚与环氧乙烷缩合物(NP40)］及Tris酚液和十二烷基硫酸钠(SDS)，醋酸钠和纯丙酮。取等量RNA(10μg)Northern分析。经变性，质量分数为1.5%琼脂糖凝胶电泳，及虹吸转印至HybondN尼龙膜；之后膜80℃烘烤2h。预热(65℃)Rapid-Hyb缓冲液(Amersham Corp.)作预杂交。在65℃用α-32P标记cDNA探针2h。随后2×SSC/0.1% SDS至0.1×SSC/0.1%SDS洗膜，-70℃中曝光24h。
4. ［3H］掺入分析：第1d，取细胞2×109个、200μl RPMI 1640+10%FCS分装96孔培养板，并重复3次，培养6h后，改用OPTI-MEM培养24h。第2d，加1×103U/L凝血酶或水蛭素培养，设对照及0.5、1、3、6h不同时间。掺入［3H］每孔最终浓度37kBq/200μl OPTI-MEM，24h后PBS洗细胞并加胰蛋白酶。细胞收集器收集细胞于Whatmann滤纸上。Beckman LS600SE计算器计数。
5. 统计学分析：用Student's t检验。
结果
1. 免疫细胞化学检测结果：抗原TF、TR和TM均有明显的免疫反应形式。TF在MiaPaCa-2和Panc-1细胞中为胞浆染色，在BxPC-3细胞为胞膜染色。TR在胰腺癌细胞中为胞浆染色(Panc-1细胞染色最强，BxPC-3细胞最弱)。TM表达表现为明显的膜染色(最强为BxPC-3，最弱为Panc-1，正好与TR相反)；同时，MiaPaCa-2也有胞浆染色。可见胰腺癌细胞TR表达越多，TM越少(表1，图1)。
表1 TF、TR和TM在3株人胰腺癌细胞中的表达
| 项目 |
Panc-1 |
MiaPaCa-2 |
BxPC-3 |
| TF |
+～++c |
+～++c |
++ |
| TR |
+++c |
++c |
+c |
| TM |
+ |
++c |
+++ |
2. Northern印迹分析：TRmRNA在野生型胰腺癌细胞株CaPan-2、MiaPaCa-2、Panc-1和BxPC-3中均有表达(图2)；凝血酶和水蛭素刺激均可减少TRmRNA的表达水平。凝血酶作为TR的激活物对TRmRNA抑制作用比水蛭素明显。
3. 凝血酶和水蛭素对胰腺癌细胞DNA合成的影响： MiaPaCa-2和Panc-1细胞与凝血酶或水蛭素一起培养分不同时间(对照、0.5、1、3、6h)显示在凝血酶刺激0.5和6h时肿瘤细胞DNA合成达高峰。MiaPaCa-2达1.5倍，Panc-1达1.2倍(P＜0.05)。水蛭素抑制MiaPaCa-2和Panc-1细胞DNA合成在0.5h时达峰值(P＜0.05)。
注：1.CaPan-2野生型；2.CaPan-2+凝血酶；3.CaPan-2+水蛭素；4.MiaPaCa-2野生型；5.MiaPaCa-2+凝血酶；6.MiaPaCa-2+水蛭素；7.Panc-1野生型；8.Panc-1+凝血酶；9.Panc-1+水蛭素；10.BxPC-3野生型；11.BxPC-3凝血酶；12.BxPC-3+水蛭素图2 胰腺癌细胞Northern印迹分析
讨论 有研究表示人胰腺癌细胞株可表达TF、TR和TM，恶性肿瘤细胞表达TF在许多恶性肿瘤血液高凝状态中起重要作用［1］。TF为复合因子参与Ⅶa因子催化激活Ⅸ、Ⅹ因子，以激活凝血旁路。激活的Ⅹ、Ⅴ因子同钙离子一起形成凝血酶原激活酶复合物，催化凝血酶原形成凝血酶。凝血酶具有多种重要的生物活性功能，通过TR发挥作用。Kakkar等［1］用免疫组织化学方法证实了TR在胰腺癌细胞上表达。本研究肯定了TR和TF在人胰腺癌细胞上表达，并且用Northern印迹证实TRmRNA在胰腺癌细胞株上的表达。但凝血酶具有对TR同源下调的作用，其机理是增加TR蛋白的降解。水蛭素是高特异性凝血酶抑制物，可减低实验性肿瘤转移［2］。本研究结果显示，水蛭素抑制TRmRNA表达。
TM也是一种TR，能中和凝血酶活性。肿瘤组织表达TM主要在细胞-细胞边缘和细胞浆内。本研究中特征性的TM染色表明，功能性TM出现在胰腺癌细胞中。MiaPaCa-2，Panc-1和BxPC-3细胞的TM表达形成沿细胞膜染色，MiaPaCa-2中还含有一定的胞浆染色。胰腺癌细胞TM表达越多，TR越少。特征性的染色表明TM在细胞-细胞之间起着细胞粘附分子作用。Tezuka等［3］研究提示TM表达减少与癌细胞转移相关。Suehiro等［4］证实TM可抑制肿瘤细胞粘附至门静脉，以防肝内转移。TM的抗凝活性通过激活蛋白C和Ⅴa、Ⅷa因子，与凝血酶形成1∶1复合物，以中和凝血酶。Fischer等［5］证实凝血酶和TR的刺激肽TRP-14能诱导黑色素细胞瘤细胞的有丝分裂。水蛭素可预防凝血酶介导的黑色素瘤细胞增生。在本研究中，凝血酶可增加MiaPaCa-2和Panc-1 DNA合成，水蛭素则使其减少。
基金项目：国家教育部留学回国人员科研活动基金资助项目(998679)
参考文献
1，Kakkar AK, Lemoine NR, Stone SR,et al. Identification of thrombin receptor with factor Xa receptor and tissue factor in human pancreatic carcinoma cells. J Clin Pathol, 1995, 48:288-290.
2，Esumi N, Fan D, Fidler IJ. Inhibition of murine melanoma experimental metastasis by recombinant desulfatohirudin, a highly specific thrombin inhibitor. Cancer Res, 1991,51:4549-4556.
3，Tezuka Y, Yonezawa S, Maruyama I, et al. Expression of thrombomodulin in esophageal squamous cell carcinoma and its relationship to lymph node metastasis. Cancer Res, 1995, 55:4196-4200.
4，Suehiro T, Shimada M, Matsumata T, et al. Thrombomodulin inhibits intrahepatic spread in human hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1995, 21:1285-1290.
5，Fischer EG, Ruf W, Mucller BM. Tissue factor-initiated thrombin generation activates the signaling thrombin receptor on malignant melanoma cell. Cancer Res, 1995,55:1629-1632.
(收稿日期：1999-07-26)
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