眼镜蛇毒溶解因子对人鼻咽癌细胞株的毒性及其与抗癌药的协同作用
癌症 1999年第0期第18卷 基础研究
作者：苏秀容 王雪敏 杨小平 黄守坚
单位：苏秀容 杨小平 中山医科大学肿瘤研究所药物室，(广州,510060)；王雪敏 黄守坚 中山医科大学药理教研室，(广州,510089)
关键词：鼻咽肿瘤；眼镜蛇毒液类；直接溶解因子；抗癌药物相互作用
【摘要】目的：探讨纯化的眼镜蛇毒因子(CVF)，CVF和单抗交联物(BAC5－CVF)和直接溶解因子(DLF)对人鼻咽癌细胞株的毒性及DLF和抗癌药的相互作用。方法：用MTT法或台盼蓝拒染法了解合并用药的细胞毒作用。结果：CVF本身对CNE2细胞并无细胞毒性；BAC5－CVF对CNE2细胞有剂量依赖性杀伤作用，其IC50为307×10－7mol/L；引起2203％抑制效应的DLE与长春碱(VLB)、甲氨蝶呤(MTX)、阿霉素(ADM)、氟尿嘧啶(5－FU)和平阳霉素(BLM)有协同作用，但能拮抗氮芥(HN2)作用。结论：CVF不引起CNE2细胞毒性，但BAC5－CVF和DLE对CNE2细胞有毒性作用；除能拮抗氮芥外，DLE和其它抗癌药对人鼻咽癌细胞株细胞毒性有协同作用。
中图号：R739.63文献标识码：A文章编号：1000－467X(1999)s0－0003－03
Cytotoxicity of cobra venom lytic factors on cultural human nasopha-
ryngeal tumor cell line and its synergism with antitumor drugs
SU Xiu－rong1， WANG Xue－ming2， YANG Xiao－ping1，et al.
1 Cancer institute,Sun Yat sen university of medical sciences,Guangzhou 510060，P.R.China
2 Department of Pharmacology，Sun Yat－sen university of medical sciences,
Guangzhou 510089,P.R.China
【Abstract】Objective： To investigate the cytotoxicity of cobra venom factor(CVF),immunoconjugate(BAC5－CVF),and direct lytic fator(DLF)on cultural human nasopharyngeal tumor cell line(CNE2)and the synergism of DLF on antitumor drug cytotoxicity.Methods： The cytotoxicity was detected using MTT method or typanblue exclusion test,the enhancement was confirmed with the combination of DLF in the level inducing 20％ growth inhibition and antitumor drugs in the level inducing 50％ growth inhibition of CNE2 cells.Results： No any cytoxicity of CVF itself on CNE2 cells was found,but BAC5－CVF can induce cytotoxicity on the same cell line in dose dependent manner,the IC50 is 3. 07× 10－7mol/L.DLF can enhance cytotoxicity of conventional antitumor drugs including VLB,MTX,ADM,5－FU,and BLM,but antagonize that of HN2.Conclusions： Both BAC5－CVF and DLF have cytotoxicity on CNE2 cells,and DLF can enhance cytotoxicity of the conventional antitumor drugs on cultural CNE2 cells except NH2.
Key words： Nasopharyngeal tumor;Cobra venoms;Direct lytic factor;Interaction between antitumor drugs
眼镜蛇毒含有两种溶细胞成份。眼镜蛇毒因子(Cobravenomfactor,CVF)和直接溶解因子(Directlyticfactor,DLF,又称眼镜蛇心脏毒素Cobracardiotoxin)。CVF本质是性质稳定的补体C3和C5激活酶，能在细胞膜表面形成补体攻膜复合物而引起细胞溶解〔1〕；而DLF在眼镜蛇毒含量最高，作用并不依赖补体存在，能引起可兴奋性细胞膜除极化和组织坏死〔2〕。本研究组曾发现DLF对不同来源的肿瘤细胞株的IC50并不相同，可能和DLF在细胞膜上的结合部位数量上的差异有关〔3〕。本研究目的是试验CVF，CVF与肿瘤细胞特异性单抗的交联物及DLF对培养肿瘤细胞株CNE2的抗瘤作用，及观察DLF与抗癌药是否有相互协同的抗瘤作用。现将实验结果报道如下：
1材料和方法
1.1眼镜蛇毒因子(CVF)
用连续柱层析技术，依次用DEAEsephadexA50，和biogelP200从眼镜蛇毒(Najanajaatra)毒中分离，在pH8.8的7.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳和0.8琼指糖电泳现单一区带。在还原性SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳现3条区带，总分子量为210000。抗补体活性(CH50)为7μg。
1.2直接溶解因子(DLF)
用DEAEsephadexA50,CMsephadexC25和sephadexG50连续柱层析技术从眼镜蛇毒中分离，纯化和脱盐，所得的DLF在pH45和10％聚丙烯酰胺凝胶电泳现单一区带，用SDS－聚两烯酰胺凝胶电泳测得分子量为6100。对小白鼠静注的LD50为2.1mg/kg。临用前用三蒸水溶解，过滤灭菌后使用。
1.3单抗交联物(BAC5－CVF)
BAC5为抗CNE2细胞膜的单克隆抗体，属IgG2a，含BAC5的腹水由我校免疫教研室提供。依次用辛酸，硫酸胺沉淀，用DEAEsephadexA25纯化〔4〕。然后把BAC5和CVF用SPDD法用二硫键交联〔5〕，对豚鼠血的溶血测定和LSAB药盒测定结果表明：BAC5－CVF的溶血单位为2.7μg，对CNE2细胞的亲和力为1∶300000。
1.4人癌细胞株
鼻咽低分化鳞状上皮癌细胞株(CNE2)，用10％小牛血清RPMI1640培养液常规传代，置37℃，5％CO2，培养箱培养，取对数生长期的细胞进行实验。
1.5药物
盐酸阿霉素(ADM)，深圳万乐药业有限公司制造(批号：9804E1)。硫酸长春硷(VLB)，明兴制药厂出产(批号：980102)。盐酸氮芥(HN2)，海普制药厂出产(批号：970502)。甲氨蝶呤(MTX)，上海华联制药有限公司出产(批号：970402)。平阳霉素(BLM)，哈尔滨博莱药业有限公司(批号：980501)。氟尿嘧啶(5－FU)，上海旭东海普药业有限公司(批号：980330)。
1.6细胞毒性测定
DLF细胞毒性用台盼蓝拒染法测定〔6〕：用0.8－1.0×105/ml单细胞悬液1ml，DLF终浓度分别为2.5、1.25、0.625、0.313、0.157μg/ml，每浓度设3个平行管，对照管加入等量的注射用水，在37℃培养48小时，用下式计算生长抑制率：
BAC5－CVF和抗癌药的细胞毒性用MTT法测定〔7〕。用下式求出生长抑制率：
半数抑制浓度(IC50)用Litchfield＆wilcoxon法〔8〕计算。药物相互作用结果判断用金正均法〔9〕，根据在量效曲线线性区内，两药合并用药的抑制率，及两个单用药的抑制率用如下公式计算q值：
当q值=1±0.15时，两药间被认为有相加作用，q值＞1.15时，两药间被认为有协同作用，当q＜0.85时,两药间有拮抗作用.
2结果
2.1CVF对CNE2细胞的作用
在33％人血清存在时，用MTT法，浓度高达5.7×10－6mol/LCVF对CNE2细胞未发现有抑制作用。
2.2BAC5－CVF对CNE2的细胞毒性
2.2.1 BAC5－CVF抑制CNE2细胞的量效关系：BAC5－CVF浓度0.91×10－7mol/L，3.4×10－7mol/L和14.6×10－7mol/L作用9小时对CNE2细胞的抑制率分别为22.1％±49％，50.6％±2.4％和86.4％±1.8％(均数±标准差，n=6)。其回归方程Y(％)=53.531lgX＋397.75，(r=0.993，n=9，IC50=3.07×10－7mol/L)。
BAC5－CVF处理的CNE2细胞在光学显微镜中可见体积变大，肿胀细胞轮廓不清，加入MTT后细胞不被着色。说明无甲攒(formazan)生成、沉积，而同等摩尔浓度范围的CVF和BAC5对CNE2细胞抑制作用微弱，未见量效关系。
2.2.2 BAC5－CVF对CNE2细胞的抑制作用的时效关系：BAC5－CVF对CNE2细胞的抑制有明显的时效关系。14.6×10－7mol/LBAC5－CVF在5h，6h，8h，9h和11h对CNE2细胞的抑制率分别为36.4±5.5％，55.0±6.1％，76.5±7.2％，86.4±6.9％和87.1±11％(n=5)。作用高峰在9小时出现。
2.3DLF对CNE2的细胞毒性
用台盼蓝拒染法测定，DLF对CNE2细胞有剂量依赖性的抑制作用，其IC50和抗癌药的IC50见表1：
表1 DLF、抗癌药对CNE2细胞的毒性作用
| 药物 |
IC50(×10－7mol/L) |
95％可信限(×10－7mol/L) |
| DLF |
1.39 |
0.535～3.61 |
| ADM |
1.44 |
0.647～3.21 |
| VLB |
0.725 |
0.452～1.16 |
| 5－FU |
16.1 |
11.3～23.0 |
| MTX |
4.73 |
2.95～7.60 |
| BLM |
0.37 |
0.073～1.88 |
| HN2 |
16.1 |
12.2～21.2 |
2.4DLF对常用的抗癌药的协同作用
根据浓度效应曲线，取引起CNE2细胞抑制20％的DLF剂量和引起CNE2细胞抑制50％抗癌药的剂量观察相互作用，结果表明，除和氮芥有拮抗作用外，DLF和常用的抗癌药的细胞毒性均有协同作用，见表2。
表 2DLF与抗癌药合并应用对CNE2细胞毒性的影响
| 药物 |
浓度(×10－7mol/L) |
单用抑制率(％) |
和DLF合用抑制率(％)值 |
q值 |
| DLF |
0.284 |
22.03 |
|
|
| ADM |
0.650 |
44.83 |
82.49 |
1.45a |
| VLB |
4.84 |
51.23 |
80.51 |
1.30a |
| 5－FU |
1.46 |
50.87 |
79.66 |
1.29a |
| MTX |
19.2 |
59.67 |
80.79 |
1.18a |
| BLM |
0.344 |
46.47 |
70.62 |
1.21a |
| HN2 |
16.0 |
49.61 |
27.97 |
0.46b |
a 两药间有协同作用，b两药间有拮抗作用
3讨论
眼镜蛇伤病人常有严重的组织坏死，其原因被归因于蛇毒含有CVF和DLF。CVF激活补体C3和补体C5，在细胞膜表面形成补体攻膜复合物，使细胞损伤〔10〕。本研究表明，在含补体的新鲜血浆存在时，CVF的单抗交联物(BAC5－CVF)对CNE2细胞有细胞毒性；但CVF并不损伤CNE2细胞，究其原因，可能是CNE2细胞有丰富的补体调节蛋白，如CD59和MCP，能清除在细胞膜表面形成补体攻膜复合物，避免出现补体引起的膜损伤〔11〕。肿瘤特异性单位抗和CVF交联物通过单抗的免疫导向，使补体在肿瘤细胞表面大量激活，超过补体调节蛋白的最大清除能力，可引起依赖补体的组织损伤。由于补体损伤发生在细胞膜，故CVF和单抗交联物不必进入细胞而起作用，CVF和单抗均为蛋白质，在体内有相近的半衰期，CVF的毒性低，不必担心在体内因肽酶水解而游离CVF的毒性问题。值得在整体动物作进一步的研究。
DLF是眼镜蛇毒含量最多的细胞毒素，虽然其作用部位也是细胞膜，但作用不依赖于补体，能被多价阳离子阻断，故其细胞毒性作用原理完全不同于CVF〔12〕。本研究采用了6种有不同作用原理的抗癌药，包括烷化剂氮芥，抗代谢药氟尿嘧啶和甲氨喋呤，植物药长春碱，抗癌抗生素阿霉素和平阳霉素。从浓度效应曲线获得的抑制20％的DLF浓度，了解DLF和IC50剂量的抗癌药的协同细胞毒性。由于所用的计量效应点位于量效曲线的直线区间，对剂量特别敏感，本研究表明，DLF能和多种常用的抗癌药的细胞毒性发挥协同作用。其原理可能和DLF损伤细胞膜，促进抗癌药进入细胞有关。然而DLF和氮芥间有相互拮抗的作用，鉴于DLF能使细胞内游离钙浓度上升CVF〔13～15〕，故其机理推测和细胞内游离钙升高能减少氮芥和作用的靶位结合有关。
基金项目：中山医科大学肿瘤中心基金和中山医科大学科学基金资助课题
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收稿日期：1998－12－30；修改日期：1999－04－12
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