鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤中癌细胞的凋亡
癌症 1999年第2期第18卷 基础研究
作者：李智 傅茂福 宗永生*
单位：中山医科大学病理学教研室(广州.510089)
关键词：鼻咽肿瘤；裸鼠移植瘤；凋亡
【摘要】目的：观察鼻咽癌细胞株CNE－1和CNE－2裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡的形态学特征，并探讨p53，bc1－2和bax在瘤细胞凋亡中所起的作用。方法：CNE－1和CNE－2鼻咽癌细胞株接种于裸鼠并在裸鼠体内连续传3代。在HE和TUNEL染色片中观察细胞株和各代移植瘤组织中癌细胞的凋亡；应用免疫组化法检测p53，bc1－2和bax基因的表达；抽提细胞株及各代移植瘤组织的DNA，以PCR－SSCP法检测p53基因第5～8外显子的改变。结果：在CNE－1和CNE－2移植瘤组织中有相当数量的瘤细胞发生凋亡，可见较大面积的“皱缩性坏死”区和众多的凋亡小体。PCR－SSCP显示p53基因第8外显子有改变，在细胞涂片和各代移植瘤组织中都有p53蛋白的积聚。3代移植瘤组织均有bax过表达，却无bc1－2表达。结论：CNE－1和CNE－2裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞死亡的主要途径是凋亡，表现为大量的“皱缩性坏死”和凋亡小体的形成；这种凋亡可能是非p53依赖性，由bax所介导的。
中图号：R739.6 文献标识码：A 文章编号：1000－467X(1999)02－0172－04
Nasopharyngeal carcinoma(NPC) cell apoptosis
in nude mice transplants
LI Zhi FU Mao-fu ZONG Yong-sheng
Department of Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089,China
【Abstract】Objective： To identify the morphological characteristics of neoplastic cell apoptosis developed in nude mice transplants of nasopharyngeal carcinoma (NPC)cell lines ,CNE-1 and CNE-2 and to investigate the roles of p53, bc1-2 and bax playing in the process of apoptosis.Methods：： CNE-1 and CNE-2 cell lines were inoculated and passed in nude mice for 3 generations. The apoptosis was detected on H＆ E and TUNEL staining slides.The expression of p53,bc1-2 and bax were observed using immunohistochemistry.p53 gene alteration was assayed in cell lines and transplant tissues by PCR-SSCP.Results：： A considerable number of neoplastic cells underwent apoptosis in CNE-1 and CNE-2 nude mice transplant tissues. The “ shrinkage necrosis” and apoptotic bodies were the main appearances of apoptosis. The p53 alteration was detected in exon 8 by PCR-SSCP and p53 protein accumulation observed in the cell smears and nude mice transplant tissue sections. All the transplant tissue sections of 3 passages showed bc1-2 negativity and bax overexpression.Conclusions：： (1)The neoplastic cells in the nude mice transplants of CNE-1 and CNE-2 cell lines underwent death mainly via apoptosis;(2)“ Shrinkage necrosis” and apoptotic bodies were the main morphological appearances of apoptosis;(3)The apoptosis developed in nude mice transplants of CNE-1 and CNE-2 NPC cell lines is highly probable through a p53-independent and bax-mediated pathway.
Key words:Nasopharyngeal neoplasms;Nude mice transplant;Apoptosis
肿瘤组织的生长主要是由瘤细胞增生和死亡的比例决定的，而细胞死亡可以是坏死或凋亡。那么在缺乏免疫功能的裸鼠鼻咽癌移植瘤组织中瘤细胞主要是以何种形式死亡的呢?其形态学特征如何?导致瘤细胞死亡的途径是什么?对这些问题的探讨有利于研究人体鼻咽癌细胞死亡的机制并为寻找新的临床治疗方案提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料
鼻咽癌细胞株CNE－1和CNE－2在RPMI1640＋10％FCS，37℃，5％CO2环境中培养。将消化成1×106浓度的CNE－1和CNE－2细胞悬液各0.5ml分别接种于5～8周龄BALB/C裸小鼠颈背部皮下，SPF环境饲养。待肿瘤长大后，处死裸鼠，取出肿瘤组织，部分进行病理检查和DNA抽提，部分重新接种于裸鼠皮下并连续在体内传3代。
1.2 TUNEL染色
采用Boehringer Mannheim公司的脱氧核苷酸转移酶荧光素缺口末端标记试剂盒(TdT－mediated dUTP－X nick end labeling kit,TUNEL,Cat.No.1684809)检测原位细胞死亡。DNA链断裂处呈紫蓝色颗粒为阳性信号。以细胞凋亡指数TI(TUNELIndexTI)作为凋亡细胞的量化指标，即观察至少10个高倍视野(10×40)内凋亡细胞和凋亡小体的均数。
1.3 免疫组化染色
采用LSAB试剂盒(DAKO K0681)，检测bc1－2(Clone 124,DAKO MO887)、bax(Bax1－19,Santa Cruz Biotechnology,Inc.Cat＃sc－930)和p53(CloneDo－7,DAKO M7001)的表达。抗体工作浓度分别为：bc1－21∶60，bax1∶100，和p531∶100。在加一抗前经柠檬酸缓冲液(pH6.0)微波预处理。DAB显色，甲基绿复染。所有免疫组化染色均设置了相应的阳性和阴性对照。p53阳性信号位于核内，而bc1－2和bax则在胞浆和胞膜。超过10％的肿瘤细胞核呈p53阳性时定为p53蛋白积聚。胞浆及胞膜出现bc1－2或bax阳性信号则为bc1－2或bax过表达。
1.4 PCR－SSCP
1.4.1 PCR引物：根据Effert等[1]已发表的引物序列(见表1)，分别扩增p53基因5，6，7，8外显子。外显子5，6，7的引物由美国North Carolina大学Lineberg癌症研究中心Nancy Roab－Traub教授惠赠。外显子8的引物由广州金华技术公司合成(Milipore公司产DNA合成仪)
表1 p53基因外显子5，6，7，8引物序列
| 外显子 |
引物序列(5'－3') |
片段长度 |
| 5 |
TTCCTCTTCCTGCAGTACT |
|
| AGCTGCTCACCATCGCTAT |
209bp |
| 6 |
GCCCTCTGATTCCTCACTGA |
|
| GCCACTGACAACCACCCTTA |
170bp |
| 7 |
TGTTGTCTCCTAGGTTGGCT |
|
| CAAGTGGCTCCTGACCTGGA |
139bp |
| 8 |
CCTATCCTGAGTAGTGGTAA |
|
| TCCTGCTTGCTTACCTCGCT |
164bp |
1.4.2 PCR：50μl反应混合物中含样本DNA0.5～1.0μg，0.2mmol/LdNTPs,5’和3’端引物各30pmol。SuperTaq0.3u(HTCo.)。5μl10×PCR缓冲液，于PTC－15PCR扩增仪(北京新技术研究所)循环扩增10×(95℃60秒，55℃60秒，72℃60秒)30×(95℃30秒，55℃60秒，72℃60秒)，共40个循环，最后于72℃延伸10分钟。SW480和Saos2细胞株DNA分别作为阳性和阴性对照。
1.4.3 SSCP：PCR产物30μl，经双蒸水稀释后，置碱变性缓冲液中，54℃变性20分钟。PCR产物变性后，立即加入10×上样缓冲液中，以300V电压于4℃恒冷条件下电泳3～5小时。
1.4.4 染色：电泳完毕后，小心剥离凝胶，置于0.5μg/ml溴化乙啶溶液中，染色20～30分钟，然后置紫外检测仪上观察DNA单链的泳动情况。2 结果
CNE－1和CNE－2细胞株接种于裸鼠皮下，分别于9天和6天后出现肿瘤结节。CNE－1和CNE－2各3代移植瘤于接种后平均22天和16天取出，荷瘤生长的裸鼠见图1。
图1 接种CNE－2细胞株18天后的第一代荷瘤裸鼠
CNE－1及CNE－2各3代裸鼠移植瘤组织在HE染色下均可见多个瘤细胞死亡灶，其中多数细胞呈“皱缩性坏死”(“shrinkage necrosis”)，少数细胞呈凝固性坏死。“皱缩性坏死”的细胞相互分离，体积缩小，胞浆高度嗜酸性，内含1－2个固缩而深染的核，少数细胞甚至不含核(图2)。凝固性坏死细胞轮廓尚存，胞浆染色较浅，核已消失。在肿瘤组织非死亡区中可见少数染色质浓聚于核膜的早期凋亡细胞以及位于细胞间和被瘤细胞吞噬的凋亡小体。凋亡小体表现为不含或含染色质的微小嗜酸性小体，被吞噬在细胞内的凋亡小体旁常有一个空晕(图3)。在TUNEL染色下，除了“皱缩性坏死”的细胞和凋亡小体呈强阳性外(图4)，早期凋亡细胞核内也有阳性信号显示。CNE－1和CNE－2各三代移植瘤组织中细胞凋亡指数TI为142.5～182.9/高倍视野，平均170±17.55/高倍视野。
图2 瘤细胞坏死灶，绝大多数瘤细胞呈
“皱缩性坏死”HE5×10；
3 肿瘤组织非死亡区内的早期凋亡细
胞和凋亡小体，以及细胞分裂像HE5×20；
4 可见多数凋亡小体TUNEL5×10；
CNE－1和CNE－2细胞株涂片和各3代移植瘤组织均呈p53蛋白的积聚(图5)，绝大多数瘤细胞呈bax过表达(图6)，未见bc1－2阳性细胞(图7)。p53基因的PCR－SSCP结果显示CNE－1和CNE－2细胞株及各3代裸鼠移植瘤组织，均有第8外显子的单链迁移变位。(图8，9)。而第5，6，7外显子则未见异常改变。
图5 裸鼠移植瘤中p53蛋白积聚DO－7IHC5×10；
6 绝大多数瘤细胞呈bax过表达baxIHC5×10；
7 裸鼠移植瘤细胞bc1－2阴性bc1－2IHC5×10
 |
 |
| 图8 CNE－1和CNE－2以及
SW480细胞株均呈第8外显
子单链迁移变位，正常对
照组织则无，p53第8外显
子的PCR－SSCP； |
图9 CNE－1和CNE－2细胞株
及其第一代裸鼠移植瘤均呈
第8外显子单链迁移变位，两
个正常对照组织均无。p53第
8外显子的PCR－SSCP |
3 讨论
我们发现将CNE－1、CNE－2接种裸鼠并在传代过程中，肿瘤组织是逐步长大的，镜下可见瘤细胞增生和死亡并存。这说明肿瘤组织的生长是在瘤细胞增生超过死亡的状态下实现的。那么，这种瘤细胞死亡是坏死还是凋亡呢?我们所见到的死亡细胞大多数是凋亡的细胞，表现为“皱缩性坏死”和凋亡小体以及染色质浓聚于核膜的早斯凋亡细胞。Kerr在1971年就提出所谓“皱缩性坏死”，1972年Kerr,Wyllie和Currie将这种特殊的细胞死亡形式定义为“凋亡”[2]。所以本实验3代移植瘤组织中见到的细胞死亡主要是凋亡，值得注意的是，裸鼠移植瘤组织中凋亡细胞的数量如此众多，这种情况在人体鼻咽癌组织中从未见过。这是由于成株的鼻咽癌细胞和人体鼻咽癌细胞在遗传特性上不同还是由于裸鼠与人体两种不同宿主所致，确值得进一步探讨。
这种瘤细胞凋亡不是细胞免疫所介导的，因为瘤细胞是在免疫缺陷的裸鼠体内生长的。我们考虑可能还是由于CNE－1、CNE－2癌细胞中发生的基因改变时导致的增生－凋亡调节失控所造成的细胞凋亡。
那么这种细胞凋亡是如何发生的呢?我们首先考虑的是目前研究较多的p53－依赖性(p53－dependent)细胞凋亡。野生型p53蛋白通过激活bax基因的启动子，上调bax的表达，形成bax/bax同二聚体，从而导致细胞凋亡[3]。有报道认为CNE－1和CNE－2是具有p53基因第8外显子280密码子杂合子点实变的细胞株[4]。同时编码野生型和突变型p53蛋白，但突变型p53型蛋白起主导作用，且能在组织中积聚[5].我们的结果显示，CNE－1和CNE－2细胞株及其各3代裸鼠移植瘤都存在p53基因第8外显子单链DNA的迁移变位，在细胞涂片和所有移植瘤组织切片中也均可见突变型p53蛋白的积聚。因为突变型p53蛋白不能激活bax基因启动子[6]，所以CNE－1、CNE－2移植瘤组织中的细胞凋亡是p53－非依赖性(p53－independent)。0’Neill等曾经报告肺小细胞癌中的瘤细胞呈非p53依赖性凋亡[7]，我们在此首次报道鼻咽癌移植瘤中瘤细胞的凋亡也是非p53依赖性的。
虽然CNE－1和CNE－2的移植瘤组织中的突变型p53蛋白不能上调bax的表达[6]，但在所有CNE－1和CNE－2移植瘤组织中却又可见到bax的过表达。虽然有文献表明[8，9]p53失活，bax过表达不一定导致细胞的凋亡，但我们考虑本实验鼻咽癌移植瘤组织中的细胞凋亡还是由于bax过表达，形成bax/bax同二聚体，引起细胞内线粒体通透性改变，最终导致的细胞凋亡[10]。所以这是一种非p53依赖，但仍由bax介导的细胞凋亡。StrobelT等(1996)[11]和JansonW等(1997)[12]曾分别报道化疗药物及丁酸盐可以引起非p53依赖性，bax增加的瘤细胞凋亡。至于CNE－1和CNE－2移植瘤中的瘤细胞凋亡是何种因素造成bax的过表达，确值得进一步研究。
本研究所探索的癌细胞凋亡机制只局限在鼻咽癌裸鼠移植瘤组织中，而人体鼻咽癌与裸鼠移植瘤是不同的。CNE－1和CNE－2移植瘤均有p53突变且未见bc1-2表达，而人体鼻咽癌却少有p53突变[5]，bc1－2和bax表达率较高(本实验室检测83例鼻咽癌组织，75例呈bc1－2阳性，大部分组织bax阳性)。因此进一步研究人体鼻咽癌癌细胞凋亡的机制就显得很有必要。
※通讯作者
基金项目：国家自然科学基金资助(No.39730200－Ⅱ)
参考文献
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2 Kerr JF, Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:A basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetice 〔J〕.Br J Cancer,1972,26:239～ 245.
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10 Pastorino JG, Chen ST, Tiffany M, et al. The overexpression of Bax produces cell death upon induction of the mitochondrial permeability transition〔J〕.J Biol.Chem,1998,273(13):7770～ 7775.
11 Strobel T, Swanson L, Korsmeyer S, et al.BAX enhances paclitaxe linduced apoptosis through a p53-independent pathway〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(24):14094～ 14099
12 Janson W, Brandner G, Siegel J. Butyrate modulates DNA-damage induced p53 response by induction of p53-independent differentiation and apoptosis〔J〕.Oncogene,1997,15(12):1395～ 1406.
收稿日期：1998－07－17；修回日期：1998－10－09
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