细胞色素P4502E1基因与鼻咽癌易感性分析
癌症 1999年第5期第18卷 基础研究
作者：贺智敏 袁建辉 王水良 赖金平 涂青松 陈主初※
单位：贺智敏 袁建辉 王水良 陈主初※，湖南医科大学肿瘤研究所（长沙，410078）；赖金平 涂青松，湖南医科大学附属湘雅医院（长沙，410008） ※通讯作者
关键词：鼻咽肿瘤；细胞色素P4502E1；遗传多态性；癌易感性
【摘 要】 目的:为了探讨鼻咽癌的病因发病机理，进一步揭示鼻咽癌的易感因素，本文进行了细胞色素P4502E1(CYP2E1)基因多态性与鼻咽癌易感性关系的研究。方法:采用病例-对照分子流行病学方法分析105例鼻咽癌患者和93例正常人体细胞CYP2E1基因型。结果:发现RsaI和PstI识别的CYP2E1基因纯合子突变型(C2/C2)在鼻咽癌人群为5.7％,显著高于正常人群（1.1％）分布（χ2=4.86,P＜0.05）;携带C2/C2基因型个体发生鼻咽癌的危险性比携带其它基因型个体高5倍左右。结论:CYP2E1基因的多态性可能是鼻咽癌易感的因素之一。
中图分类号:R739.62;Q551文献标识码:A文章编号:1000-467X(1999)05-0517-03
Association between genetic polymorphism of human cytochrome P450 2E1 gene and susceptibility to nasopharyngeal carcinoma
HE Zhi-min,YUAN Jian-hui,WANG Shui-liang,et al.
Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha 410078,P.R. China
【Abstract】 Objective:Nasopharyngeal carcinoma(NPC) have been thought to be linked to nitrosamine exposure,while cytochrome P450 2E1(CYP2E1) is responsible for the metabolic activation of precarcinogens such as nitrosamines. The object of this paper is to investigate the possible role of CYP2E1 genetic polymorphisms in the etiology of NPC.Methods:Using the case-control molecular epidemiologic method,we detected a restriction fragment length polymorphism (RFLP) of human CYP2E1 gene for the restriction endonuclease Rsa Ι and PstΙ on DNA isolated from blood samples from NPC cases(105)and normal control (93).Results: Among healthy control, the allelic frequency of wild-type and variant-type CYP2E1 were 81％ and 19％ ,respectively,using RsaΙ and PstΙ enzyme digestion, while genotype frequency of wildtype homozygotes (C1/C1), heterozygotes (C1/C2) and variant homozygotes (C2/C2) were 63.4％ , 35.5％ and 1.1％ ,respectively,for the normal control and 68.6％ ,25.7％ and 5.7％ ,respectively,for the NPC cases. There was a significant difference between case and control which carried CYP2E1 gene C2/C2 genotype identified by RsaΙ and PstΙ (χ2=4.86,P＜0.05). As compared with individuals who were homozygous for the wild type(C1/C1) and heterozygous CYP2E1 gene(C1/C2),those found to be homozygous for the variant form of gene were 5 fold excess risk of developing NPC (95％ confident interval="0.57-" 41.90).Conclusion:The genetic polymorphisms of CYP2E1 gene may be one of the susceptible causes to NPC.
Key words: Cytochrome P450; Nosopharyngeal carcinoma; Genetic polymorphism; Cancer susceptibility
鼻咽癌是中国南方最常见的恶性肿瘤之一,病因主要涉及亚硝胺类化学致癌物[1]。环境中的亚硝胺类需经体内代谢方具致癌活性，因而个体的代谢能力可能涉及鼻咽癌的易感性。细胞色素P4502E1是亚硝胺类代谢的主要酶类[2]，其基因具有多个限制性内切酶片段长度多态性（RFLP），如位于该基因上游5’-侧端区RsaΙ和PstΙ识别位点等[3]。晚近的研究发现:这些位点所在区域可能与CYP2E1基因的调控有关[4];其位点多态性涉及肺癌、肝癌等易感性[5，6]。本文采用PCR-RFLP方法对CYP2E1基因调控序列中RsaΙ和PstΙ位点多态性与鼻咽癌的易感性进行了初步分析，为鼻咽癌病因发病学机制提供进一步证据。
1 材料与方法
1.1 研究对象和标本制备
鼻咽癌血标本来自附属湘雅医院耳鼻喉科、放疗科,经病理学检查确定的初诊病人，正常血标本绝大部分来自健康献血员，少量为高龄鼻咽炎患者。病例组和正常组的年龄、性别分布基本一致。鼻咽癌组105例，其中男性77例占73.3％，女性28例占26.7％，平均年龄47.7岁，(年龄范围23～70岁);正常对照组93例，其中男性64例占68.8％，女性29例占31.2％，平均年龄40.8岁，(年龄范围22～65岁)。
取病人和正常人静脉血3～5ml（EDTA抗凝），用淋巴细胞分离液（上海生化制品厂）分离出有核粒细胞，常规抽提DNA，TE溶解后贮存于4℃待用。
1.2 PCR-RFLP分析
PCR扩增的引物序列为5’-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA/5’-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG，扩增产物为包括RsaΙ和PstΙ酶切位点的CYP2E1基因5’-旁侧区序列，控制长度为410bp。整个实验参照有关文献报道的方法[5]略加修改，在每样本50μl扩增体系中，含DNA模板1μl（0.2μg-0.5μg),25mmol/LMgCl23μl,2mmol/LdNTP5μl,引物2μl（10pmol),Taq酶0.5μl（2.5单位）（扩增试剂均为Promega产品）。98℃5min变性后，按94℃1min,55℃1min,72℃1min于PE480型PCR仪（美国PE公司）运行30个循环。用氯仿抽提扩增产物后分置二份，分别用于RsaΙ和PstΙ酶切（37℃，18hr），直接将酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，分析基因型。
1.3 统计分析
以χ2检验确定基因型分布差异的显著性，以比值比OR及95％可信限表示相对危险度。
2 结果
本文采用PCR-RFLP方法分析了105例鼻咽癌和93例正常人体细胞CYP2E1基因。发现PCR产物经RsaΙ或PstΙ酶切后分别产生了三种不同的CYP2E1基因型，包括纯合子野生型（C1/C1）、杂合子（C1/C2）和纯合子突变型（C2/C2）（如图1，图2）；RsaΙ和PstΙ的酶切位点及产物大小虽有区别，但所反映的每例样本的CYP2E1基因型完全一致；93例正常健康人CYP2E1基因型的等位基因频率分布是:野生型81％;突变型19％。整个鼻咽癌和正常组的基因型分布见表1。在正常组中，RsaΙ和PstΙ识别的C1/C1，C1/C2和C2/C2分别为63.4％，35.5％和1.1％，突变型频率（C1/C2和C2/C2合计）为36.6％,与鼻咽癌组(31.4％)无显著差异(χ2=0.58,P＞0.25），但正常组携带C2/C2个体却明显低于鼻咽癌组（χ2=4.86，P＜0.05),即携带RsaΙ和PstΙ识别的C2/C2发生鼻咽癌的危险性比C1/C1或C1/C2高5倍左右(95％可信限为0.57～41.90）。
表1 鼻咽癌和正常人CYP2E1基因型频率
及与鼻咽癌危险性的关系
|
CYP2E1基因型
(PstI或RsaI) |
正常对照
(n=93) |
鼻咽癌组
(n=105) |
相关危险性
(RR) |
95％可信限
(95％CI) |
|
C1/C1 |
59(63.4％) |
72(68.6％) |
1.0 |
|
|
C1/C2 |
33(35.5％) |
27(25.7％) |
0.67 |
0.35～1.20 |
|
C2/C2 |
1(1.1％) |
6(5.7％) |
4.90 |
0.57～41.90 |
鼻咽癌组与正常对照比P＜0.05
图1 PCR扩增产物Rsal酶切后的RFLPs分析。图示样
品在1.5％琼脂糖凝胶上电泳后所见的三种带型：
第1道，罕见型纯合子C2C2，第2道，杂合子C1C2，第
3道，野生型纯合子C1C1，M.PCRMarker
图2 PCR护增产物Psatl酶切后的RFLPs分析。图
示样品在1.5％琼脂糖凝胶上电泳后所见的三种带型：
第1道，罕见型纯合子C2C2第2道，杂合子C1C2，第3
道，野生型纯合子C1C1，M.PCRMarker
3 讨论
化学致癌物启动体内肿瘤形成一般需要经历致癌物代谢活化、DNA损伤、癌基因活化和/或抑癌基因失活等过程。与鼻咽癌发生有关的环境致癌物亚硝胺类主要由细胞色素P4502E1代谢活化，因而该酶基因的活性可能与鼻咽癌的易感性有关。Hayashi等[4]曾对CYP2E1基因5’-侧端携带RsaΙ和PstΙ识别的上游序列测序分析，发现二内切酶识别的C2/C2型在C1/C1型基础上分别产生了C→T和G→C的点突变，并根据在体外表达的实验结果提出RsaΙ和PstΙ识别的C2/C2型比C1/C1型高。本研究分析了鼻咽癌和正常对照CYP2E1基因上游调控序列RsaΙ和PstΙ限制性内切酶长度片段多态性（RFLP），发现携带RsaΙ和PstΙ识别的C2/C2型个体发生鼻咽癌的危险性比携带C1/C1和C1/C2型个体高5倍左右，提示携带RsaΙ和PstΙ识别的C2/C2型个体CYP2E1基因活性高，因而对鼻咽癌的发生具有易感性。早在1990年，Watanabe等[3]就已提出在CYP2E1基因的上游存在两个完全连锁的呈现多态性的内切酶位点RsaΙ和PstΙ；本实验使用两酶同时检测每例样本，发现它们所反映的基因型在每一个体均显一致，与Watanabe的结果一致，进一步证实CYP2E1基因的调控序列作为一个整体所呈现的遗传多态性是协调一致的，同时，该结果也对本实验的可靠性提供了佐证。
近年有关CYP2E1基因多态性与癌症易感性的关系的研究报道结果不尽一致。如日本学者曾多次报道[7，8]肺癌的易感性与DraΙ和RsaΙ识别的CYP2E1基因多态性有关，而西方白种人中的一些研究[9，10]却未能发现两者的相关性，造成这种不一致的原因尚不清楚，可能与白种人DraΙ和RsaΙ识别的突变型CYP2E1非常罕见有关。本研究发现健康人等位基因频率分布上，突变型达18.7％，远高于西方人而与日本人相近[5]，是否与鼻咽癌发病的种族差异有关尚需进一步探讨。
基金项目:国家自然科学基金资助（基金号：39570623）
〔参考文献〕
〔1〕 Hildesheim A,Levine PH. Etiology of nasopharyngeal carcinoma:a review〔J〕.Epidemiol Rev,1993,15:466～485.
〔2〕 Nouso K,Thorgeirsson SS,Battula N. Stable expression of human cytochrome P450 ⅡE1 in mammalian cells:metabolic activation of nitrosodimethylamine and formation of adducts with cellular DNA〔J〕. Cancer Res,1992,52:1796～1800.
〔3〕 Watanabe J,Hayashi S,Nakachi K,et al. PstⅠ and RsaⅠ RFLP in complete linkage disequilibrium at the CYP2E gene〔J〕. Nucleic Acids Res,1990,18:7194.
〔4〕 Hayashi S,Watanabe J,Kawajiri K.Genetic polymorphism in the 5＇-flanking region change the transcriptional regulation of the human cytochrome P450 Ⅱ E1 gene〔J〕.J Biochem,1991,110:559～565.
〔5〕 Kato S,Shields PG,Caporaso NE,et al. Cytochrome P450Ⅱ E1 genetic polymorphisms,racial variation,and lung cancer risk〔J〕. Cancer Res,1992,52:6712～6715.
〔6〕 Yu MW,Gladek-Yarborough A,Chiamprasert S,et al. Cytochrome P450 Ⅱ E1 and glutathione S-transferase M1 polymorphisms and susceptibility to hepato. cellular carcinoma〔J〕. Gastroenterology,1995,109:1266～1273.
〔7〕 Uematsu F,Kikuchi H,Motomiya M,et al. Association between restriction fragment length polymorphism of the human cytochrome P450Ⅱ E1 gene and susceptibility to lung cancer〔J〕. Jpn J Cancer Res,1991,82:254～256.
〔8〕 Uematsu F,Rawa S,Kikuchi H,et al. Restriction fragment length polymorphism of the human CYP2E1 (cytochrome P450Ⅱ E1)gene and susceptibility to lung cancer:possible relevance to low smoking exposure〔J〕. Pharmacogenetics,1994,4:58～63.
〔9〕 Hirvonen A,Husgafvel-Pnrsiainen K,Anttila S,et al. The human CYP2E1 gene and lung cancer:DraⅠ and RsaⅠ restriction fragment length polymorphism in a Finnish study population〔J〕. Carcinogenesis,1993,14:85～88.
〔10〕 Persson I,Johansson I,Bergling H,et al. Genetic polymorphism of cytochrome P450 2E1 in a Swedish population. Relationship to incidence of lung cancer〔J〕.FEBS Lett,1993,319:207～211.
收稿日期:1999-03-09;修回日期:1999-04-23
用户登录 
新用户注册