鼻咽癌组织中CDK4和p16蛋白的表达
癌症 2000年第1期第19卷 基础研究
作者：戴文斌 陈蔚麟 蒋一强 任占平 唐德艳
单位：戴文斌 陈蔚麟 蒋一强 任占平 唐德艳（广西柳州市人民医院病理科，广西柳州545001）
关键词：鼻咽癌；免疫组化；CDK4；p16
摘 要：目的：为了观察CDK4和p16蛋白在鼻咽癌组织中的表达状态，探讨其与鼻咽癌的发生、发展关系。方法：应用S-P免疫组化法检测CDK4和p16蛋白在60例鼻咽癌和20例正常鼻咽部粘膜组织中的表达。结果：60例鼻咽癌中CDK4和p16蛋白表达率分别为66.7％和23.3％。高分化鳞癌p16蛋白的表达率明显高于低分化鳞癌（P＜0.01)。21例淋巴结转移阳性组中p16蛋白的表达率低于14例阴性组（P＜0.05)，而CDK4蛋白表达率高于阴性组（P＜0.05）。结论：提示CDK4蛋白的过度表达与p16蛋白的低表达可能涉及鼻咽癌的发生、发展过程。p16蛋白的表达缺失与鼻咽癌细胞分化、转移有关。CDK4蛋白的过度表达与鼻咽癌的转移有关。
分类号：R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000467X（2000）01－0034－03
A study of CDK4 and p16 protein in nasopharyngeal carcinoma
DAI Wen bin1 CHEN Wei lin
（Department of Pathology， Liuzhou People s Hospital, Liuzhou 545001,P.R.China）
JIANG Yi qiang, et al.
（Department of Pathology， Guangxi Medical University,Nanning 530021,P.R.China）
Abstract：Objective：To evaluate the role of CDK4 and p16 protein expression in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods：The S-P immunohistochemical method was used to detect the expression of CDK4 and p16 protein in 60 cases of NPC and 20 cases of normal tissues.Results：The positive expression rates of CDK4 and p16 protein in NPC were 66.7％ and 23.3％ , respectively.The positive expression rate of p16 protein was higher in well differentiated squamous cell carcinoma than in poorly differentiated squamous cell carcinoma (P＜0.01). A significant correlation was found between low expression of p16 protein, over expression of CDK4 protein and cervical lymph node metastasis (P＜ 0.05 ).Conclusions：The results suggest that the inactivation of p16 protein and over expression of CDK4 protein may be involved in the carcinogenesis and development of NPC and implicated in tumor defferentiation and metastasis.
Key words：Nasopharyneal carcinoma ; Immunohistochemistry; CDK4; p16 ▲
p16基因是新近发现的一个重要抑癌基因，其表达产物p16蛋白能特异地与CDK4或cyclinD1CDK4复合物结合，抑制CDK4的活性，对细胞增殖周期起负调节作用［1］ 。为了探讨鼻咽癌发生、发展中CDK4和p16蛋白的作用，我们应用免疫组化S-P法检测鼻咽癌组织中这两种蛋白的表达。
1材料与方法
1.1材料
取自我院1995年至1997年病理诊断确诊为鼻咽癌的活检标本存档蜡块60例和正常鼻咽部粘膜组织20例作为研究对象。按1991WHO的“上呼吸道和耳肿瘤的组织学分类”标准分为：高分化鳞癌7例，低分化鳞癌48例，未分化癌5例。其中有颈部淋巴结转移者21例，无颈部淋巴结转移者14例。所有标本均做5μm连续切片供HE和免疫组化染色。
1.2免疫组化
试剂：鼠抗人CDK4（MS-616-P0）单克隆抗体为美国NeoMarkers生物公司产品，工作浓度1∶30。兔抗人p16多克隆抗体为Zymed公司产品（即用型）。SP试剂盒和DAB显色剂盒为Maxin公司产品。
染色方法：免疫组化染色采用链菌素亲生物素—过氧化物酶（SP）免疫组化法。抗CDK4和p16两种抗体孵育前，切片需微波处理暴露抗原，操作按说明书进行，DAB显色。以PBS液代替一抗作阴性对照，用已知大肠癌CDK4和p16蛋白阳性切片为阳性对照。
1.3结果判断
CDK4以细胞核而p16以细胞核和细胞浆出现明显的棕黄色颗粒为阳性标记。根据阳性细胞着色的范围分为阴性（－）：阳性细胞数＜10％；弱阳性（＋）：阳性细胞数10％～25％；中度阳性（＋＋）：阳性细胞数25％～50％；强阳性（＋＋＋）：阳性细胞数＞50％。
1.4统计学分析
采用χ2检验。
2结果
2.1CDK4和p16的表达情况
免疫组化检测表达的情况见表1。CDK4蛋白表达主要定位于细胞核内（图1），其中2例鼻咽癌细胞核、浆均阳性。癌旁组织未见CDK4蛋白阳性。20例正常鼻咽部粘膜上皮细胞中有4例少部分细胞可见CDK4蛋白阳性，但阳性细胞数小于10％。60例鼻咽癌组织中CDK4蛋白阳性表达40例，阳性率66.7％。p16蛋白表达主要定位于细胞浆中，少数见于细胞核内（图2）。鼻咽癌细胞、癌旁增生上皮及正常鼻咽部粘膜上皮细胞中均可见p16蛋白阳性表达。60例鼻咽癌组织中p16蛋白阳性表达14例，阳性率23.3％。癌旁增生上皮中p16蛋白阳性率为43.3％，20例正常鼻咽部粘膜上皮细胞均阳性。
表1 鼻咽癌和正常鼻咽部粘膜组织中p16和CDK4蛋白表达的情况
| 类型 |
n |
p16 |
阳性率(％) |
P值 |
CDK4 |
阳性率(％) |
P值 |
| - |
+ |
++ |
+++ |
- |
+ |
++ |
+++ |
| 鼻咽癌 |
|
60 |
46 |
4 |
7 |
3 |
14(23.3) |
|
20 |
7 |
21 |
12 |
40(66.7) |
|
|
高分化鳞癌 |
7 |
2 |
0 |
2 |
3 |
5(71.4) |
＜0.01* |
3 |
0 |
3 |
1 |
4(57.1) |
|
| 低分化鳞癌 |
45 |
38 |
3 |
4 |
0 |
7(15.6) |
|
15 |
4 |
16 |
10 |
30(66.7) |
|
| 未分化癌 |
8 |
6 |
1 |
1 |
0 |
2(25.0) |
|
2 |
3 |
2 |
1 |
6(75.0) |
|
| 正常鼻咽部粘膜 |
20 |
0 |
4 |
4 |
12 |
20(100.0) |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
0(0.0) |
|
| 颈部淋巴结转移 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
阳性组 |
21 |
17 |
2 |
2 |
0 |
4(19.0) |
＜0.05 |
4 |
5 |
7 |
5 |
17(80.9) |
＜0.05 |
|
阴性组 |
14 |
5 |
1 |
5 |
3 |
9(64.3) |
|
8 |
1 |
4 |
1 |
6(42.9) |
|
*:高分化鳞癌与低分化鳞癌比较,P＜0.01.
图1鼻咽鳞状细胞癌癌细胞核内CDK4阳性颗粒SP×400
图2鼻咽鳞状细胞癌癌细胞浆和少数细胞核内p16阳性颗粒SP×400
2.2CDK4和p16蛋白的表达与癌细胞分化程度的关系
各类型鼻咽癌CDK4和p16蛋白的表达情况见附表。CDK4蛋白在各类型癌组之间阳性率差异无显著性（P＞0.05)。p16蛋白在高分化鳞癌的阳性率明显高于低分化鳞癌和未分化癌，其中高分化鳞癌与低分化鳞癌之间阳性率差异有高度显著性(P＜0.01），高分化鳞癌与未分化癌及低分化癌与未分化癌之间阳性率差异无显著性（P＞0.05）。
2.3CDK4和p16蛋白的表达与患者颈部淋巴结转移的关系
淋巴结转移阳性组中（21例）CDK4蛋白的阳性表达显著高于阴性组（14例），p16蛋白的阳性表达则显著低于阴性组。两者差异均具有显著性（P＜0.05）。
2.4CDK4和p16蛋白在癌组中表达的关系
在60例鼻咽癌组织中，CDK4蛋白的阳性表达率（66.7％)明显高于p16蛋白的阳性表达率（23.3％），其中14例p16蛋白阳性的癌组中有4例CDK4蛋白阴性，46例p16蛋白阴性的癌组中有30例CDK4蛋白阳性。但CDK4蛋白的过度表达和p16蛋白低表达经统计学处理，未见到明显的关系（P＞0.05）。
3讨论
细胞周期调控的分子机制涉及细胞周期蛋白（cyclin）、细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）以及CDKs抑制蛋白（CKIs）三种分子的相互作用，其核心是CDKs的活性表达及调控。CDK4蛋白是CDKs蛋白家族中重要一员，其含量及活化程度在细胞增殖周期由G1期向S期过渡过程中起限速作用。现认为cyclinD1是原癌基因。在细胞周期调控中，cyclinD1的过度表达及p16的失活和异常，均可导致细胞增殖、分化失控，增加细胞癌性转化的可能性。此外，有证据表明在某些肿瘤和细胞系中CDK4有明显的扩增或异常表达［2］ 。Wang等［3］ 对19例黑色素瘤研究，发现其中11例CDK4蛋白表达阳性（58％）。本研究发现仅在鼻咽癌细胞中可观察到CDK4蛋白的阳性表达，阳性率为66.7％。癌旁增生上皮及正常鼻咽部粘膜上皮CDK4蛋白全为阴性，揭示在鼻咽癌细胞中CDK4蛋白的过度表达可能涉及鼻咽部粘膜上皮细胞的异常增殖和癌变过程。CDK4蛋白表达与鼻咽癌的淋巴结转移有关，而与组织学分型、分化程度无明显相关性。在4例正常鼻咽部粘膜增生上皮中少部分细胞有CDK4蛋白表达（细胞数＜10％），可能反映上皮细胞的复制所致。
p16蛋白特异性地抑制CDK4蛋白的活性，导致一系列的底物（如pRb）保持持续去磷酸化高活性，使细胞周期停滞在G1/S期，因而抑制细胞增殖，呈现抑癌基因作用［4］ 。uander Riet等［5］ 报道29例头颈部鳞癌中有21例（72％）有杂合性缺失，证明了p16抑癌基因的灭活是头颈部鳞癌中最常见的基因改变。黄倩等报道鼻咽癌组织p16基因的缺失达61％。我们的研究发现60例鼻咽癌中p16蛋白的阳性率为23.3％，明显低于癌旁增生上皮及正常鼻咽部粘膜上皮。其中高分化鳞癌阳性率明显高于低分化鳞癌（P＜0.01）。高分化鳞癌阳性率亦高于未分化癌，但两者差异无显著性，可能与两者病例数较少有关。有颈部淋巴结转移的p16蛋白阳性率明显低于无颈部淋巴结转移者，具有显著相关性（P＜0.05）。以上表明p16基因失活可能与鼻咽癌分化不良、淋巴结转移有关。
我们在分析本组癌组中CDK4与p16蛋白表达之间的关系中发现。在4例p16蛋白阳性的鼻咽癌细胞无CDK4蛋白表达。在30例CDK4蛋白阳性的病例中无p16蛋白表达，且CDK4蛋白的阳性表达仅见于鼻咽癌中，相反，在癌旁增生上皮及全部正常鼻咽部粘膜上皮中有p16蛋白阳性而CDK4蛋白阴性。这些发现提示p16蛋白的丢失及或CDK4的激活可能与鼻咽癌的发生、发展有因果关系。然而CDK4蛋白的过度表达和p16蛋白低表达的明显相反关系未被检出。我们认为这可能与许多不同于p16的CDKs/cyclin抑制剂，如p15、p21/WAF1/Cip1，p27/Kip1，Sdil及Picl未被检测，此外p53及转化生长因子β（TGF-β）在这些CDK抑制剂的上调步骤中可作为细胞增生的抑制剂［3］ ，通过多种调节，从而减少CDK4的表达和激活，同时也可能与本组检测的病例数较少等因素有关，因而CDK4和p16蛋白之间的相反关系在肿瘤细胞中未被检出。
＊通讯作者：Tel：86－772－2812439
Fax：86－772－2855233
参考文献：
［1］付国，吕昌龙．p16和p15基因缺失与白血病［J］ ．国外医学肿瘤学分册，1997，24（1）：52～64.
［2］张晓晖，黄高升，王文亮．细胞周期的网络调控系统cyclinsCDKsCKIs及其与肿瘤的关系［J］ ．国外医学肿瘤学分册，1997，24（2）：77～80.
［3］Wang YL，Uhara H，Yamazaki Y，et al.Immunohistochemical detection of CDK4 and p16INK4 proteins in cutaneous malignant melanoma［J］．Bri J Dermatol，1996，134：269～275．
［4］李伟峰，赵彤，邹霞英，等．MTS1／p16基因产物在非小细胞肺癌中的表达及其意义［J］ ．实用癌症杂志，1998，13（3）：176～178.
［5］刘德胜，于鸿琴，袁锡兰，等．肿瘤抑制基因p16与头颈部肿瘤［J］ ．国外医学肿瘤学分册，1998，25（1）：30～31．
收稿日期：1999－03－11
修回日期：1999－04－06
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