精细定位和克隆9p21－22区域内鼻咽癌候选抑瘤基因
癌症 2000年第1期第19卷 快速报道
作者：阳剑波 宾亮华 李忠花 张小慧 钱骏 张必成 周鸣 谢奕 邓龙文 李桂源
单位：阳剑波 宾亮华 李忠花 张小慧 钱骏 张必成 周鸣 谢奕 邓龙文 李桂源（湖南医科大学肿瘤研究所，湖南长沙410078）
关键词：鼻咽癌；染色体9p21-22；杂合性丢失；抑瘤基因；克隆
摘 要：目的：进一步精细限定鼻咽癌9p21-22区域等位基因杂合性丢失的频率和范围，筛选和克隆其共同缺失区内鼻咽癌相关的候选抑瘤基因。方法：应用11个定位于9p21-22区域的高密度微卫星位点，检测25例低分化鼻咽癌患者的杂合性丢失，确定其共同缺失区；用RTPCR和Northern筛出在鼻咽癌细胞株HNE1和鼻咽癌活检组织中表达下调的、定位于共同缺失区内的3'末端ESTs（ExpressSequenceTags)；采用RACE技术和生物信息学资源克隆出候选EST的全长cDNA。结果：25例患者中有17例(68％)存在一个或多个位点的杂合性丢失，其中D9S161(35.0％，7/20)，D9S1678(31.5％，6/19)，D9S263(33.3％，6/18)和D9S1853(33.3％，7/21)四个紧邻位点的丢失频率相对较高，并发现六位患者在该四个位点表现为连续性缺失；筛选D9S161～D9S1853区域内25个代表新基因的3'末端ESTs序列，发现一个EST(dbEST：208825)在鼻咽癌细胞株HNE1及73％（11/15）的活检组织中表达降低，MultipleTissueNorthern(MTNTM)Blots杂交结果显示该EST在心、脑组织中存在大小约2.4kb和3.5kb的两个转录本。通过测定包含该EST的cDNA克隆，获得该新基因(命名为NAG6基因)2.4kb转录本的全长cDNA(GenBank登录号：AF149298）。结论：鼻咽癌染色体9p21-22区域D9S161D9S1853位点之间(2.7cM)是鼻咽癌患者的一个较小共同缺失区，定位于该区域内的新基因NAG6可能是一个与鼻咽癌相关的候选抑瘤基因。
分类号：R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000－467X(2000)01－0006－04
Refined localization and cloning of a novel putative tumor suppressor gene associated with nasopharyngeal carcinoma on chromosome 9p21-22
YANG Jian bo， BIN liang hua， LI zhong hua， et al.
Cancer Research Institute， Hunan Medical University， Changsha 410078,P.R.China
Abstract：Objectives：To further refine the extent of deletion on chromosome 9p21-22 in nasopharyngeal carcinoma(NPC) and clone a new putative tumor suppressor gene associated with NPC.Methods：Loss of heterozygosity (LOH) on chromosome 9p21-22 was analyzed in 25 paired blood and tumor samples by using 11 high-density microsatellite polymorphic markers; the expression of 3' end express sequence tags (ESTs) localized with in common deletion region was investigated in NPC cell line HNE1， primary culture nasopharyngeal epithelial cells and NPC biopsies by using differential RT-PCR and Northern hybridization. Rapid amplification of cDNA ends (RACE) and bioinformatic data were used to clone putative EST full-length cDNA. Results： Seventeen of 25 cases (68％ ) showed LOH at one or more loci. Higher frequencies of LOH were found at four loci： D9S161 (35.0％ )， D9S1678 (31.5％ )， D9S263 (33.3％ ) and D9S1853 (33.3％ )， where 6 cases had a contiguous stretch of allelic loss; 25 ESTs localized within D9S161～ D9S1853 were investigated and one EST (dbEST： 208825) was downexpressed in NPC cell line HNE1 and in 73％ (11/15) NPC biopsies. Multiple tissue blot revealed that this putative EST hybridized to two different size transcripts (approximately 2.4 kb and 3.5 kb ) in fetal heart and brain tissues. A near full-length cDNA of 2.4 kb transcript of this EST was cloned (named NAG-6 gene) and there is no significant homology with any known genes.Conclusions：The minimal common region of deletion might be defined between D9S161 and D9S1853 (estimated about 2.7 cM in extent) at 9p21.1， the new gene NAG-6 located in this region may be a putative tumor suppressor gene associated with NPC.
Key words：Nasopharyngeal carcinoma； Chromosome 9p21-22； Loss of heterozygosity； Gene cloning； Tumor suppressor gene ▲
近年研究表明，9p21～22区域的等位基因杂合性丢失(LossofHeterozygosity，LOH)现象是鼻咽癌等多种肿瘤中的共同事件，提示该区域内存在一个或多个与肿瘤发生密切相关的抑瘤基因[1～4]。p16/MTS-1基因被定位于9p21区域，认为是多种肿瘤在该区域内抑瘤基因的主要候选者[5～7]。要证实或发现9p21～22区域鼻咽癌相关抑瘤基因，还需进一步精细限定鼻咽癌患者在该区域内的等位基因杂合性丢失频率及范围。因此，我们应用11个定位于9p21～22区域的高密度微卫星多态性标记，对25例低分化鼻咽癌患者进行了LOH分析，以期确定其较小共同缺失区，并用定位-候选克隆策略，利用定位于共同缺失区内的ESTs进一步筛选和克隆鼻咽癌相关抑瘤基因。
1材料与方法
1.1标本
25例原发性鼻咽癌活检组织均来源于湖南医科大学湘雅医院及附属第三医院未经放疗和化疗的确诊鼻咽癌患者，同时抽取其对应外周血为对照标本。所有癌标本病理检测证实均为低分化鳞癌，并根据TNM分期法进行临床分期。
1.2微卫星位点PCR扩增
按常规方法苯酚氯仿抽提癌组织及外周血DNA，稀释成100ng/μl，4℃保存。查询dbSTS库，选择11对高密度覆盖9p21～22区域的微卫星多态性标记，其引物均购自ResearchGeneticsInc.。PCR50μl反应体系中含基因组DNA200ng；上、下游引物各0.2～0.3μmol/L；1.5～2.0UTaqDNA聚合酶(华美公司)；95℃变性5min，94℃50s，52℃～58℃60s，72℃60s反应32个循环，72℃延长10min。取5～8μlPCR产物用甲酰胺变性示踪液稀释1倍，95℃变性5min，上样于8％变性聚丙烯酰胺凝胶(含8mol/L尿素)，550v电泳2～3小时分离后，在0.2％硝酸银溶液染色15min，用1.5％NaOH和0.4％甲醛溶液显色至PCR产物带型清晰，干燥后保存。
1.3LOH判定
当患者为某一微卫星多态性标记的杂合子时，相应外周血DNA的PCR扩增产物表现为两条等位基因片段，可提供信息用于LOH分析；若为纯合子则不能提供信息。与相应外周血DNA的PCR扩增条带比较，若肿瘤组织中某一等位基因条带消失或其中一条相对密度减少50％以上，判定为LOH。判定为LOH的标本需重新进行PCR及电泳确定。
1.4RNA抽提
按TRIZOTM试剂盒（GIBICOLBRL公司）说明提取鼻咽癌细胞株HNE1、15例鼻咽癌活检组织和10例原代培养的正常鼻咽上皮细胞RNA。
1.5差异RT-PCR
用DNase-Ⅰ消化RNA中痕量DNA后，按逆转录试剂盒（Promega公司）说明作逆转录，取5μl逆转录产物加入GAPDH引物和EST引物（购自Research GeneticsInc.）一起扩增，PCR反应参数：95℃变性4min，94℃50s，50℃～58℃60s，72℃60s反应27个循环，72℃延长10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6Northern杂交
按“分子克隆实验指南”及MultipleTissueNorthern(MTNTM)Blots(＃7760-1，CLONTECH公司)说明操作。
1.7cDNA测序
cDNA克隆质粒购自ResearchGeneticsInc.，用质粒纯化试剂盒（Promega公司）抽提质粒，API自动测序仪测序。
1.8用于cDNA序列分析的Internet各类数据库
The National Centerfor Biotechnology Information(NCBI)，GenomeDatabase(GDB)，The Sanger Centre，Swissprotein等。
2结果
25例鼻咽癌患者中，17例(68％)存在一个或多个位点的LOH，7例患者表现为不同程度的连续性LOH，其中位于9p21.1的D9S161位点丢失频率最高，为35％(7/20)，与该位点相邻的D9S1678、D9S263、D9S1853位点丢失频率均相对较高，为31.5％～33.3％(详见表1)。值得注意的是与p16/MTS-1基因最近的位点D9S1870丢失频率并不高，为16.6％（3/18）。从11个微卫星位点缺失图谱(图1)分析，6位患者T-7，T-8、T-17、T-21、T-25和T-27在D9S161-D9S1853之间均存在连续性杂合性丢失，该两位点间的遗传距离约为2.7cM，距p16/MTS-1基因约14cM(图2)。
表1 鼻咽癌染色体9p21-22区域的11个微卫星多态性位点等位基因杂合性丢失频率
| 位点 |
位置 |
遗传距离(cM) |
LOH例数/杂合子例数(％) |
| D9S156 |
9p22 |
|
2/17(11.7) |
| D9S162 |
9p22 |
3.8 |
2/18(11.1) |
| D9S1870 |
9p21.1 |
3.2 |
3/18(16.6) |
| D9S171 |
9p21.1 |
5.5 |
4/18(22.2) |
| D9S169 |
9p21.1 |
6.2 |
4/17(23.5) |
| D9S161 |
9p21.1 |
2.1 |
7/20(35.0) |
| D9S1678 |
9p21.1 |
|
6/19(31.5) |
| D9S263 |
9p21. |
0.8 |
6/18(33.3) |
| D9S1853 |
9p21.1 |
1.9 |
7/21(33.3) |
| D9S165 |
9p21.1 |
4.3 |
3/18(16.6) |
| D9S1874 |
9p13.1 |
2.6 |
1/17(5.8) |
□：杂合子无丢失；■：杂合性丢失；N：没有信息
1 部分鼻咽癌病人染色体9p21-22区域的11个微卫星多态性位点等位基因杂合性丢失检测结果
图2 代表微卫星多态性位点LOH凝胶图片
查询dbEST数据库，选择定位于D9S161-D9S1853区域内25个代表新基因的3'末端ESTs序列，RT-PCR和Northern检测其在鼻咽癌细胞株、鼻咽癌活检组织及原代培养正常鼻咽上皮组织中的表达情况，发现一个327bp的EST(dbEST：208825)在鼻咽癌细胞株HNE1及73％（11/15）的活检组织中表达降低，Multiple Tissue Northern(MTNTM)Blots杂交结果显示该EST在心、脑组织中存在大小约2.4kb和3.5kb的两个转录本，而在胎盘、肺、肝、骨胳肌、肾、胰腺组织中无明显表达（图3、4）。查寻GenBank，进行同源性分析，发现该EST与一个1.8kb的cDNA3'末端完全相同，并含有polyA尾，但无完整的阅读框架。在此基础上，采用5'RACE扩增技术向5’端延伸，但未获得该EST的全长cDNA；通过查寻UniGene库，获得一个包含该EST的约2.4kb大小的cDNA克隆，测序得到2258bp，含有1017个核苷酸的完整阅读框架（GenBank登录号：AF149298）。
图3 RT-PCR分析NAG-6基因在鼻咽癌活检组织中的表达
M：PCRmarker;N：正常鼻咽上皮活检组织；T：鼻咽癌活检组织
图4 NAG-6基因MultipleTissueNorthern(MTNTM)Blots及鼻咽癌细胞株HNE1Northern杂交结果
1：心，2：脑，3：胎盘，4：肺，5：肝，6：骨骼肌，7：肾，
1′、3′：原代培养正常鼻咽上皮细胞，2′、4′：鼻咽癌细胞株HNE1，5′：脑组织。
3讨论
较多研究表明，9p21～22区域的高频等位基因杂合性丢失是多种肿瘤发生发展过程中的共同事件。乳腺癌、膀胱癌、肺癌及黑色素瘤等肿瘤中9p21～22区域的LOH频率为43％～57％[2～4]，在头颈部癌中为81％[9]；在鼻咽癌中，Huang等用21对微卫星多态性标记检测了9号染色体长臂和短臂等位基因缺失情况，发现18例低分化鳞癌患者中有11例(61％)存在LOH，其范围在9p23～9q21.1之间[2]。本研究检测了25例鼻咽癌患者9p21～22区域的LOH，其频率为68％(17/25)，丢失频率最高的是D9S161位点(35.0％，7/20)，其结果与Huang等的基本相符。与Huang的研究不同的是，我们采用高密度覆盖9p21～22区域的11个微卫星多态性标记(平均遗传距离约1.5cM)，构建了9p21～22区域的精细杂合性缺失图谱(图1)，发现7例患者(T-7，T-8，T-12，T-17，T-21，T-25，T-27)在D9S162D9S165之间表现为不同程度的连续性LOH，其中6例患者(T-7，T-8，T-17，T-21，T-25，T-27)在D9S161-D9S1853间同时存在杂合性丢失，且这些位点具有相对较高的LOH频率，本实验结果与我室李忠花博士已完成的96例鼻咽癌患者全基因组扫描结果相符（与国家人类基因组南方研究中心合作课题，资料未公开），这提示D9S161-D9S1853可能是部分鼻咽癌患者的较小共同缺失区(约2.7cM)，该区域位于9p21.1，距p16/MTS-1基因约14.0cM。p16/MTS-1基因定位于9p21区域，其产物p16蛋白和CDK4或CDK6结合，在G1期控制细胞的增生。在多种肿瘤如乳腺癌、肺癌、食管癌、膀胱癌及鼻咽癌中已发现其存在杂合性和纯合性缺失，故认为p16/MTS-1基因是多种肿瘤9p21-22区域抑瘤基因的主要候选者[5～7]，但较多的研究结果表明在9p21-22区域可能还存在除p16/MTS-1基因外的其它未知抑瘤基因。在乳腺癌中，Han和Brenner的不同研究表明，9p21-22区域等位基因的最小共同缺失区在p16/MTS-1基因附近的D9S171-D9S169间[3]；Jonathan等在肺癌的9p21-22区域LOH研究中发现其最小共同缺失区位于距p16/MTS-1基因约8cM的D9S171-D9S259间[8]；Tarmin等发现食管癌9p的LOH高频区是距p16/MTS-1基因较远的D9S165位点[9]；Pamela等在研究原发性头颈部癌9p21-22区域的LOH中，发现D9S171和D9S161位点的LOH频率高于距p16/MTS-1基因最近的D9S1747位点[7]；本研究结果亦显示D9S161-D9S1853间是鼻咽癌患者9p21-22区域的一个较小共同缺失区。因此，在D9S161-D9S1853间可能存在与鼻咽癌相关的抑瘤基因。
近年来，随着人类ESTs数目的剧增和被定位，利用ESTs发现和克隆新基因，已成为目前最快捷、经济有效的克隆策略之一。为发现D9S161D9S1853区域内可能存在的新的鼻咽癌相关抑瘤基因，我们采用定位候选克隆策略，在dbEST库中筛选出该区域内25个代表新基因的3'末端ESTs序列，并检测其在鼻咽癌中的表达差异情况，发现了一个EST(dbEST：208825)在鼻咽癌中表达降低，通过cDNA克隆测序获得了一个2258bp的序列，计算机同源性匹配分析为新基因，其中包含一个长1017碱基的完整阅读框，1180-1182位为起始密码子ATG的起始位点，其上游有同一阅读框的终止密码子TGA;2194-2196位为编码框架的终止密码子TGA，其下游有加尾信号及polyA尾，因此，可以认为获得了该新基因2.4kb转录本的全长cDNA，命名为NAG-6基因。Swiss-protein相应软件预测其编码338个氨基酸，分子量为36843.92道尔顿，pI为7.81，具有PKC、Tyrosine磷酸激酶位点及EGF-likedomain，定位于细胞浆。该新基因是否为鼻咽癌候选抑瘤基因的功能研究正在进行当中。
基金项目：本课题受国家863项目（102－10－01－05）和973重大项目（“疾病基因组学”理论和技术体系的建立鼻咽癌子项目）资助。
*通讯作者：Tel：86－731－4474411－2101
Fax：86－731－4474411－2101
E-mail：ligy@public.cs.hn.cn
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收稿日期：1999－10－20
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