EB病毒LMP1促鼻咽癌细胞生长与CD23、bcl－2表达和凋亡的关系
癌症 2000年第2期第19卷 基础研究
作者：黄培春 梁洪英 邓惠华 赵明伦 何志巍
单位：黄培春（广东医学院病理生理教研室，广东 湛江 524023）；梁洪英（广东医学院病理生理教研室，广东 湛江 524023）；邓惠华（广东医学院病理教研室，广东 湛江 524023）；赵明伦（广东医学院病理生理教研室，广东 湛江 524023）；何志巍（广东医学院病理生理教研室，广东 湛江 524023）
关键词：EB病毒；潜伏膜蛋白1；鼻咽癌细胞系；CD23；bcl-2；细胞凋亡
【摘 要】目的:探讨EB病毒LMP1表达促鼻咽癌细胞系生长作用与CD23、bcl-2表达和细胞凋亡的关系。方法:用免疫组化LSAB法检测LMP1、CD23和bcl-2蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用DNA电泳法、流式细胞法和TUNEL法检测癌细胞凋亡;用CD23单抗阻断和MTT法观察CD23单抗对鼻咽癌细胞系生长的影响。结果:表达LMP1的鼻咽癌细胞系（L-CNE1）的生长能力明显增强，并有CD23蛋白表达，而非表达LMP1的鼻咽癌细胞系（V-CNE1和CNE1）的CD23表达阴性;3种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生，而都仅有2％～3％的细胞表达bcl-2蛋白;CD23单抗能明显地抑制L-CNE1细胞系的生长，但对V-CNE1和CNE1细胞系的生长无明显影响。结论:提示LMP1促鼻咽癌细胞系生长可能是通过上调CD23所致，而与bcl-2的表达和细胞凋亡无关。
中图分类号：R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000－467X（2000）02－0124－04
Relationship between growth of nasopharyngeal carcinoma cells Stimulated by EBV latent membrane protein 1 and the expression of CD23, bcl-2 or apoptosis
HUANG Pei-chun LIANG Hong－ying
（Department of Pathohpysiology, Zhanjiang 524023，P.R.China）
DENG Hui－hua
（Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023，P.R.China）
【Abstract】 Objective: To explore the relationship between the growth of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells stimulated by EBV latent membrane protein 1 (LMP1) and the expression of CD23, bcl-2 or apoptosis.Methods: The expressions of LMP1,CD23 and bcl-2 were detected by using immunohistochemistry method (LSAB). The growth of NPC cells was determined with MTT assay. Apoptotic carcinoma cells were identified by DNA electrophoresis, flow cytometry analysis and the terminal deoxynucletidyl transferase-medicated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL).The effect of CD23 monoclonal antibody to the growth of nasopharyngeal carcinoma cells was also observed. Results:The growth of LMP1 expressing NPC cells (L-CEN1) was apparently increased. CD23 protein was positive in L-CNE1 cells and negative in LMP1 negative NPC cells (V-CEN1 and CNE1).No apoptotic carcinoma cells was detected, and bcl-2 positive cells were 2％ ～ 3％ in all 3 NPC cell lines. The growth of L-CNE1 cell was inhibited by CD23 monoclonal antibody. Conclusion: It is likely that growth of NPC cells is stimulated by LMP1 through CD23 up-regulation, but not related to the expression of bcl-2 and apoptosis.
Key words：Epstein-Barr virus;Latent membrane protein1;Nasopharyngeal carcinoma cell line;CD23;bcl-2;Apoptosis
鼻咽癌与EB病毒（Epsein-Barr virus,EBV）关系密切，EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein1,LMP1)是EBV在鼻咽癌上皮细胞中表达的唯一与细胞转化有关的癌蛋白[1]，它是由LMP癌基因编码的产物。因此LMP1在鼻咽癌发病中的作用已被关注。我们的实验曾用LMP1基因真核表达质粒转染LMP1表达阴性的人高分化鼻咽癌细胞系CNE1，发现LMP1表达可促进鼻咽癌细胞系生长并促进鼻咽癌细胞系的表皮生长因子（epithelial growth factor,EGF）自分泌[2]。但关于LMP1促鼻咽癌细胞系生长的机制尚不清楚。本文进一步研究LMP1表达的促鼻咽癌细胞系生长作用与CD23、bcl-2表达和细胞凋亡的关系，旨在探讨LMP1在鼻咽癌发病中的机理。
1 材料和方法
1．1 细胞系与细胞培养
表达LMP1的鼻咽癌细胞系CNE1(L-CNE1)为段朝军等所制备，其质粒和转染方法见文献[2]。LMP1表达阴性的鼻咽癌细胞系CNE1，包括用不含LMP1基因质粒转染的CNE1（V-CNE1）和不转染的CNE1。以上细胞系用含15％小牛血清RPMI-1640培养液常规培养。
1.2 LMP1、CD23、bcl-2的检测
采用免疫组化法(LSAB法)。LMP1、CD23、bcl-2单克隆抗体及LSAB试剂盒均为Dake公司产品，单抗用TrisHCl缓冲液（TBS）释稀，工作浓度分别为1∶40、1∶100、1∶60。消化、收集各种生长良好的贴壁细胞涂片，自然风干后用丙酮甲醇(1∶1)4℃固定10min。分别用LMP1、CD23、bcl-2单抗，按LSAB试剂盒说明书操作，最后用苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。以镜下所见明显的棕黄色颗粒为阳性。每种检测均用TBS代替一抗作阴性对照。
1.3 细胞倍增能力的检测
用MTT法。分别将5×104/ml的细胞L-CNE1、V-CNE1和CNE1加入96孔培养板，每孔100μl，每种细胞分2组，每组设12个平行孔，其中一组于37℃、5％CO2培养4h后加入MTT，另一组于37℃、5％CO2培养48h后加入MTT，每孔10μlMTT（5mg/ml）。加MTT后继续培养4h，加入DMSO，每孔100μl，静置16h后用全自动酶标仪测定570nm、630nm波长的OD值，并按以下公式
计算出每种细胞的平均OD值。每种细胞均同时测定含15％血清和无血清培养液培养的倍增能力。
1．4 细胞凋亡的检测
采用以下三种方法分别检测L-CNE1、V-CNE1和CNE1细胞系在15％血清及无血清培养下的细胞凋亡。
1．4．1 DNA电泳法:按常规酚抽提法提取细胞DNA。取10μgDNA样品和5μl样品缓冲液混合，在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中电泳，电压5V/cm，电泳2h后于紫外灯下观察结果。
1．4．2 流式细胞仪检测法:参照文献[3]方法略加修改。贴壁细胞经胰酶消化、收获用PBS洗2次，调细胞浓度为2×106/ml，分装每管0.3ml，每管加入PI染液（其中含PI100mg/L，RNase100mg/L，0.1％Triton－X100,0.1％醋酸钠）0.7ml作用30min,用流式细胞仪（美国Coulter公司生产的EPLCSXL型）检测。
1．4．3 末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标志法（TUNEL）：检测试剂盒为Boehringer mannheim公司产品，碱性磷酸酶底物坚固红及缓冲液为博士德公司出品。收获细胞涂片，凉干后用4％多聚甲醛（PBS配）固定20min，PBS洗1次，再用0.1％Triton-X100柠檬酸缓冲液冰浴处理2min。用PBS洗后滴加TUNEL反应液，37℃孵1h。用PBS洗去反应液后滴加碱性磷酸酶联接的抗荧光素抗体（Converter-AP）,37℃孵30min，PBS洗后滴加碱性磷酸酶底物坚固红溶液，室温反应10～30min，水洗后用苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察结果。
1．5 阻断CD23作用实验
分别将3种细胞用培养液调至5×104/ml，加入CD23单抗，终浓度为1∶100。3种细胞均设空白对照组，对照组加入等量PBS。将细胞混匀后加入96孔培养板，每孔100μl，每组设12个平行孔。置37℃、5％CO2培养48h，然后用MTT法测定每组细胞的平均OD值，以观察CD23单抗对细胞倍增能力的影响。
1．6 统计学方法
实验结果的统计学处理采用t检验。
2 结果
2．1 LMP1、CD23、bcl-2表达的检测结果
免疫组化检测结果显示，L-CNE1细胞系的LMP1呈强阳性反应，V-CNE1和CNE1细胞系均为阴性;大部分L-CNE1细胞的CD23呈中等强度阳性反应，而V-CNE1和CNE1细胞系均为阴性;L-CNE1、V-CNE1和CNE1细胞系均见少数细胞的bcl-2呈强阳性反应，阳性率为2％～3％，三种细胞系的阳性率无统计学差异（P＞0.05）。而各种检测中用TBS代替一抗的阴性对照组全为阴性（图1～4）。
图1 L-CNE1细胞胞浆和胞膜LMP1阳性（棕黄色）。LSAB法 ×400
图2 L-CNE1细胞胞浆CD23阳性（棕黄色）。LSAB法 ×400
图3 鼻咽癌细胞胞浆和核膜bcl-2阳性（棕黄色）:
中仅见少数（2个）阳性细胞，L-CNE1、
V-CNE1和CNE1细胞的阳性率相近。LSAB法×400
图4 TBS代替一抗的阴性对照的鼻咽癌细胞
（无棕黄色）。LSAB法×400
2．2 表达LMP1的鼻咽癌细胞生长能力的变化
如图5所示，表达LMP1的L-CNE1细胞系的倍增能力明显增强。在15％血清和无血清培养条件下，L-CNE-1的OD值分别为3.04±0.22和2.69±0.83，明显高于LMP1阴性的V-CNE1和CNE1细胞系（P＜0.001），后两者分别为2.40±0.13、1.46±0.35和2.43±0.12、1.51±0.61,V-CNE1和CNE1之间无论是15％血清或无血清培养的OD值都无统计学差异（P＞0.05）。
图5 3种细胞系的生长能力测定：L-CNE1细胞无论在5％血清
或无血清培养下的生长能力均明显增强(MTT法)
2．3 细胞凋亡的检测结果
三种细胞系的DNA电泳均无细胞凋亡特有的梯状DNA条带;流式细胞仪测定细胞DNA含量，三种细胞系均未发现亚G1期细胞峰即凋亡峰（见图6～7）；用敏感的末端脱氧核苷酸转移酶介导核苷酸缺口标志法检测凋亡细胞，三种细胞系均未见染成红色的凋亡细胞。三种方法检测结果显示，三种细胞系在15％血清和无血清培养条件下，其细胞凋亡均处于抑制状态。
图6 L-CNE1细胞系的凋亡细胞测定：
无亚G1期凋亡峰(流式细胞仪分析法)
图7 V-CNE1细胞系的凋亡细胞测定：
无亚G1期凋亡峰(流式细胞仪分析法)
2．4 CD23表达与细胞生长的关系
为了解CD23表达与鼻咽癌细胞生长能力的关系，用CD23单抗阻断CD23的作用，观察细胞倍增能力的变化。结果显示，加入CD23单抗培养48h后，CD23表达阳性的L-CNE1细胞系的OD值比空白对照组明显降低（P＜0.001），而CD23表达阴性的V-CNE1和CNE1细胞系则无明显变化（图8）。
图8 CD23单抗对L-CNE1细胞系生长的影响：
CD23单抗能明显地抑制L-CNE1细胞系系的生长，
但对V-CNE1和CNE1细胞系的生长无明显影响(MTT法)
3 讨论
LMP1的表达可促进鼻咽癌细胞的生长已有报道[2，4]，本文进一步证实了LMP1的表达无论在15％血清或无血清培养条件下均可显著地增强人高分化鼻咽癌上皮细胞系CNE1的生长能力。然而，引起细胞的倍增能力增强有两种可能，一是由于LMP1癌基因表达使细胞的增殖能力增强，二是由其引起细胞凋亡减少。为了解表达LMP1的CNE1细胞倍增能力增强是否与细胞凋亡减少有关，本文用不同方法检测了细胞凋亡。结果显示，表达LMP1的CNE1细胞系与非表达LMP1的CNE1细胞系（包括空质粒转染和非转染的CNE1）一样，细胞凋亡均已被明显地抑制，在15％血清和无血清培养条件下均无明显细胞凋亡。结果表明，LMP1表达促CNE1细胞生长是通过增强细胞增殖能力所致，而与细胞凋亡抑制无关。同时也提示，鼻咽癌细胞的细胞凋亡已严重抑制，后者在鼻咽癌的发生发展中可能起重要作用。
大量研究已证实bcl-2原癌基因表达可抑制细胞凋亡。也有研究表明，LMP1表达可通过上调bcl-2的作用而抑制人B淋巴细胞的凋亡[5，6]。但最近国内刘克拉等[7]的研究发现，人鼻咽癌组织中的LMP1与bcl-2的表达无相关性，bcl-2的表达也不能抑制鼻咽癌细胞凋亡。本文结果表明，表达LMP1和非表达LMP1的CNE1细胞仅有极少数表达bcl-2，但细胞凋亡均已被抑制。提示CNE1细胞中的LMP1表达不能上调bcl-2的表达，而其细胞凋亡的抑制不是bcl-2过度表达所致，而可能是癌变过程中的其他因素作用的结果。
CD23是分子量为45kD的糖蛋白，其脱落到液体中的可溶性片段(sCD23)能与具有EBV受体作用的CD21分子结合，促进细胞增殖，因而CD23具有细胞生长因子作用[8]。有研究表明，EBV感染B淋巴细胞可使CD23分子上调[9]。但鼻咽癌细胞中的LMP1表达是否可上调CD23而促进癌细胞增殖，迄今尚不清楚。本文结果显示:表达LMP1的CNE1细胞系的CD23呈阳性表达，而非表达LMP1的CNE1细胞系的CD23则呈阴性;用CD23单抗能抑制表达LMP1的CNE1细胞系的生长，但不能抑制非表达LMP1的CNE1细胞系的生长。表明LMP1在NPC细胞中表达可通过上调CD23而促进细胞增殖。联系我们原先的研究发现LMP1表达可促进CNE1细胞的EGF自分泌的结果[2]，我们认为:LMP1在CNE1细胞中的表达可促进鼻咽癌细胞的生长，这种促生长作用是通过细胞增殖能力增强而非通过凋亡抑制所致。LMP1表达促进CNE1细胞增殖的机制与EGF自分泌增加和CD23上调有关，至于两者是通过同一途径的不同环节作用或是通过不同途径作用，尚需作进一步的研究。
[编辑：钟均行；校对：甘可建]
基金项目：本课题受广东省高教厅重点科研基金（高9502）资助
通讯作者：黄培春：Tel：86－759－2388587
Fax：86－759－2284104
E-mail：huangpc@gdmc.edu.cn
[参考文献]
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收稿日期:1999－05－11;修回日期:1999－06－28
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