鼻咽癌中p53蛋白积聚对瘤细胞有丝分裂和凋亡的影响
癌症 2000年第5期第19卷 基础研究
作者：钟碧玲 宗永生
单位：钟碧玲 宗永生(中山医科大学病理学教研室，广东 广州510089)
关键词：鼻咽肿瘤；p53蛋白；有丝分裂；凋亡
【摘要】目的：观察疗前鼻咽癌组织中p53蛋白的积聚及其对瘤细胞有丝分裂和凋亡的影响。方法：随机收集1997年疗前鼻咽癌活检标本43例。采用免疫组化LSAB法DO7一抗检测p53蛋白的表达。在H＆E染色切片上计数有丝分裂图像，平均每个高倍视野下的瘤细胞有丝分裂数为有丝分裂指数（mitotic index，MI）。采用TUNEL原位细胞死亡试剂盒检测瘤细胞凋亡，平均每个高倍视野下的凋亡瘤细胞数为凋亡指数（TUNEL index，TI）。比较高于和低于不同p53阳性瘤细胞百分率的两组间MI均数有无差异，以确定p53蛋白积聚的标准。比较有无p53蛋白积聚两组间的MI均数和TI均数。结果：在43例疗前鼻咽癌活检标本中，见到p53阳性瘤细胞≥20％以上时，两组MI均数开始显示有差异，从而将p53阳性瘤细胞≥20％定为p53蛋白积聚。43例中有37例p53蛋白积聚，积聚率为86.05％（37/43）。37例有p53蛋白积聚组的MI均数为1.87±1.78/HPF，6例无p53蛋白积聚组MI均数为0.76±0.63/HPF，两者有显著性差异，P＜0.05。但是，37例TI的均数为24.50±26.66/HPF，6例TI的均数为23.17±25.30/HPF，统计学上无差异性。结论：在疗前鼻咽癌活检中，p53蛋白阳性瘤细胞数≥20％时可定为p53蛋白积聚，积聚率达86.05％。p53蛋白积聚可以促进鼻咽癌细胞的增殖，表现为有丝分裂指数增高；但鼻咽癌中p53蛋白的积聚对瘤细胞的凋亡并无影响。
中图分类号：R739.63文献标识码：A文章编号：1000－467X(2000)05－0432－04
Effects of p53 protein accumulation on neoplastic cell mitosis and apoptosis in nasopharyngeal carcinoma
ZHONG Bi-ling, ZONG Yong-sheng＊
Department of Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences,
Guangzhou 510089, P. R. China
【 Abstract】 Objective： To investigate the p53 protein accumulation and its effects on neoplastic cell mitosis and apoptosis in pretreated nasopharyngeal carcinomas. Methods： Forty-three pretreated NPC biopsy samples in the year 1997 were randomly collected for this study. p53 protein expression was detected by LSAB immunohistochemistry using DO-7 primary antibody. Mitotic figures were counted on H＆ E stained slides, and apoptotic cells on TUNEL-stained slides by use of in-situ cell death detection kit. Both of mitotic and apoptotic cells were quantitated by cell numbers per one high power field averagely in terms of mitotic index (MI) and TUNEL index (TI), respectively. To compare the mean MIs of two groups categorized by different percentages of positive p53, positive cells found in NPC specimens was taken for the purpose of designating the criterion of p53 accumulation. And then, the correlation of p53 accumulation with MI and TI was made by statistical analysis. Results： Because significant difference appeared at the criterion of 20％ , the p53 protein accumulation of NPC was defined as ≥ 20％ of positive cells. The p53 protein accumulation thus could be determined in 37 out of 43 NPCs(86.05％ ). The mean MI (1.87± 1.78/HPF) of 37 NPCs with p53 accumulation was significantly higher than that (0.76± 0.63/HPF) of 6 NPCs without p53 accumulation ( P＜0.05). However, there was no statistical difference between the mean TI (24.50± 26.66/HPF) of 37 NPCs with p53 accumulation and TI (23.17± 25.30/HPF) of 6 NPCs without p53 accumulation. Conclusions： p53 protein accumulation of NPC could be designated by ≥ 20％ of positive neoplastic cells found in pretreated NPC specimens. The accumulated p53 could enhance cell proliferative activity in pretreated NPCs represented by increasing of MI, but showed no effect on neoplastic cell apoptosis.
Key words： Nasopharyngeal neoplasm; p53 protein; Mitosis; Apoptosis
p53基因的变异是许多恶性肿瘤形成过程的一个重要分子事件[1]，但在鼻咽癌中p53基因的突变率却较低[2]。作者实验室傅茂福等1994年PCR-SSCP的结果显示，在18例鼻咽癌标本中4例(22.2％)有异常迁移带，其中1例在外显子5，3例在外显子8[3]。但是，p53蛋白的积聚（accumulation）率或称过表达（overexpression）率却可达80％左右[4,5]。由于野生型p53蛋白半衰期短，仅20～30分钟,因此采用免疫组化法不易在组织中检测到[6]；但鼻咽癌活检组织体积很小,且取材后能获得迅速固定，可在切片中的少数瘤细胞核内检测到未被完全降解的野生型p53蛋白是完全可以理解的。那么，鼻咽癌组织中p53蛋白阳性瘤细胞数超过什么百分率，才能认为是p53蛋白积聚？野生型p53蛋白主要是调控细胞从G1期进入S期，从而通过有丝分裂使细胞增殖[7]，我们知道,积聚或过表达是半衰期延长的结果,而半衰期延长则可以是突变型p53蛋白或野生型p53蛋白与其他病毒蛋白或细胞蛋白[8]结合所致。本研究的目的就是以开始影响鼻咽癌细胞有丝分裂指数为标准来确定什么百分率才定为p53蛋白积聚或过表达;并进一步探讨鼻咽癌中p53蛋白积聚对瘤细胞增殖和凋亡的影响。
1材料和方法
1.1病理标本
随机收集1997年中山医科大学病理学教研室、附属肿瘤医院病理科未经治疗的鼻咽癌活检标本43例。组织经10％福尔马林固定、石蜡包埋。切片粘贴于经2％APES丙酮溶液处理的载玻片上。
1.2染色
除常规的H＆E和细胞角蛋白免疫组化染色外，采用DAKO公司生产的能识别变性和非变性野生型或突变型位于p53蛋白N末端20-25氨基酸抗原决定簇的DO-7（M7001）单克隆抗体(1∶100稀释)和LSAB试剂盒检测p53蛋白的表达。每例切片均做了TUNEL（TdT-mediated dUTP-X nick end labeling）染色或称原位细胞凋亡检测。采用Boehringer Mannheim公司的末端标记检测试剂盒（目录号：1684809）。实验步骤按试剂盒说明书进行。
1.3观察及计数
在H＆E切片上，高倍(5×40）和油镜(5×100)下观察鼻咽癌细胞的有丝分裂图像，记数5个以上高倍视野中癌细胞有丝分裂数目，取其平均值,即每个高倍视野中的有丝分裂细胞数(No./HPF)为有丝分裂指数(mitoticindex)，以MI表示。光镜下观察p53蛋白在癌组织中的表达，以阳性瘤细胞在所有瘤细胞中占有的百分数作为量化指标。在H＆E和TUNEL切片上,高倍和油镜下观察凋亡中的鼻咽癌细胞和凋亡小体,记数5个以上高倍视野中的凋亡细胞数目,取其平均值,即每个高倍视野中的凋亡细胞数(No./HPF)为凋亡指数(TUNELindex),以TI表示。
1.4统计学处理
均数的差异以t检验；相关性采用Spearman公式。
2结果
2.1鼻咽癌细胞的p53蛋白表达、有丝分裂图像和凋亡
p53蛋白见于鼻咽癌细胞核内,呈棕黄色（图1）。瘤细胞的有丝分裂可以是生理性（图2a、2b），但多为不对称的病理性（图2c、2d）。凋亡中的瘤细胞和凋亡小体散在性地分布在瘤组织中（图3）。凋亡中的癌细胞核内染色质每呈边集（图4a、6b）、浓缩（图4b、5、6a）或断裂（图4c、6c），而凋亡小体则可位于细胞间隙中（图5）或被周围细胞所吞噬(图4d）。
2.2各个不同p53蛋白阳性鼻咽癌细胞百分率的MI均数
在43例未经治疗的鼻咽癌活检标本中，癌细胞p53蛋白的表达率从5％到95％不等，中位数为70％。比较高于和低于不同p53蛋白阳性鼻咽癌细胞百分率两组之间的MI均数，并采用t检验,分析其间有无统计学上的差异。发现以≥20％和＜20％划线，两组间的MI均数开始有差异性。表1显示，43例中鼻咽癌细胞表达率≥20％的标本有37例，其MI均数为1.87±1.78/HPV,＜20％者6例,MI均数仅为0.76±0.63/HPV,两组间的P值＜0.05。以≥25％和＜25％划线以后各百分率两组间，P值均＜0.05。
表1 高于和低于不同p53蛋白阳性鼻咽癌细胞
百分率两组间的MI均数比较
| p53
蛋白阳性
癌细胞
百分率 |
n |
MI( ±s) |
t |
P |
| ≥10％ |
42 |
1.75±1.72 |
|
|
| ＜10％ |
1 |
0.43 |
| ≥15％ |
38 |
1.84±1.76 |
2.54 |
＞0.05 |
| ＜15％ |
5 |
0.75±0.70 |
| ≥20％ |
37 |
1.87±1.78 |
2.85 |
＜0.05 |
| ＜20％ |
6 |
0.76±0.63 |
| ≥25％ |
36 |
1.92±1.78 |
3.29 |
＜0.05 |
| ＜25％ |
7 |
0.68±0.62 |
图1非角化性鼻咽癌，示癌巢中大量p53蛋白核阳性的瘤细胞。DO-7、LSAB免疫组化法，×200。
图2未分化鼻咽癌,2a、2b示瘤细胞核的生理性有丝分裂，2c、2d示瘤细胞核的病理性有丝分裂。H＆E×500。
图3未分化鼻咽癌，示凋亡中的瘤细胞和凋亡小体。TUNEL原位细胞死亡检测法，×200。
图4未分化鼻咽癌，示凋亡中的瘤细胞核染色质边集（4a）、浓缩（4b）、和断裂（4c）以及凋亡小体为邻近瘤细胞所吞噬（4d）。H＆E×500。
图5未分化鼻咽癌，示凋亡中的瘤细胞和数个位于细胞间隙中的凋亡小体。H＆E,×500。
图6未分化鼻咽癌，示凋亡中的瘤细胞核染色质浓缩（6a）、边集（6b）、和断裂（6c）。TUNEL原位细胞死亡检测法，×500。
表2 43例鼻咽癌中有无p53蛋白积聚两组间
MI均数和TI均数的比较(±ｓ)
| 鼻咽癌组别 |
n |
MI |
TI |
| 有p53蛋白积聚组(≥20％) |
37 |
1.87±1.78 |
24.5±26.66 |
| 无p53蛋白积聚组(＜20％ ) |
6 |
0.76±0.63 |
23.17±25.3 |
| P |
|
＜0.05 |
＜0.05 |
| 总例数 |
43 |
1.72±1.38 |
24.33±26.11 |
2.2p53蛋白积聚与MI均数和TI均数的关系
在43例鼻咽癌中，p53蛋白阳性癌细胞的百分率，或称p53蛋白的表达率与MI和TI之间，经Spearman等级相关检验，无相关性，r’s分别为0.228和0.146，P值均＞0.05。以≥20％鼻咽癌细胞核呈p53蛋白阳性为p53蛋白积聚标准,则本文43例鼻咽癌p53蛋白的积聚率为86.05％(37/43)。37例呈p53蛋白积聚与6例不呈p53蛋白积聚的MI均数和TI均数见表2。从表2可知，MI均数在有无p53蛋白积聚两组之间有差异性，P值＜0.05；而TI均数在有无p53蛋白积聚两组之间则无差异性，P值＞0.05。3讨论
p53蛋白具有多个抗原决定簇[9]。作者实验室钱洪流等曾采用不同的一抗（CM-1、pAB1801、pAB240和pAB421）检测鼻咽癌中p53蛋白的表达,说明鼻咽癌中表达的p53蛋白，其抗原性不一致[4]。即使采用同一种一抗,石蜡切片经不经微波处理,结果也不一样.钱洪流等以CM-1一抗不经微波处理检测288例鼻咽癌,≥10％p53阳性瘤细胞的病例117例,阳性率为40.6％[4];而傅茂福等亦以CM-1一抗经微波处理检测36例鼻咽癌,≥25％p53阳性瘤细胞的病例达17例,阳性率为52.8％(未正式发表材料,见1994年6月中山医科大学“傅茂福博士学位论文”)。那么,石蜡切片经微波处理采用DO-7单抗检测鼻咽癌时,究竟p53蛋白阳性瘤细胞达到什么百分率,才算能排除残留的未被完全降解的野生型p53蛋白而定为p53蛋白积聚,从而开始显示积聚p53蛋白的功能呢?本文结果显示,在石蜡切片经微波处理采用DO-7单抗检测p53蛋白有无积聚时,可以以细胞的有丝分裂指数开始显示差异性时的≥20％和＜20％来划线。根据这一标准,本文43例鼻咽癌的p53蛋白积聚率为86.05％(37/43)。傅茂福等采用微波处理DO7单抗检测36例鼻咽癌,以≥25％和＜25％划线,p53蛋白积聚率为88.9％(31/36)(见上述“傅茂福博士学位论文”)。两批材料的检测结果一致。文献中各学者对鼻咽癌所定的p53蛋白积聚标准不一致[10]。本文的成果有利于今后统一标准,使各学者在研究鼻咽癌p53蛋白积聚所获得的数据和结论具有可比性。
作者实验室过去的工作说明,鼻咽癌中积聚的p53蛋白已经丧失了阻止受损DNA癌细胞通过G1期的监控点(check-point)进入S期的功能。钱洪流等249例鼻咽癌中CM-1的表达率与PCNA表达率呈正相关；40例鼻咽癌中CM-1的表达率与Ki-67表达率呈正相关[4]。傅茂福54例鼻咽癌DO-7的表达程度与PCNA的表达程度呈正相关(见上述“傅茂福博士学位论文”)。这些事实均提示,在鼻咽癌中积聚了的p53蛋白由于丧失了监控瘤细胞从G1期进入S期的功能,从而促进了癌细胞的增殖。本文从瘤细胞有丝分裂指数的角度,进一步论证了上述观点，因为细胞有丝分裂指数与PCNA或Ki-67表达率一样也能反映细胞增殖的程度。可是,正如“傅茂福博士学位论文”及其他学者研究结果所提示的那样,在鼻咽癌中所积聚的p53蛋白约1/5为突变型,而4/5则为野生型p53蛋白与其他蛋白结合的产物。因此,我们可以得出这样的结论,即在鼻咽癌中，p53蛋白的积聚(可以是突变型p53蛋白或野生型p53蛋白与其他蛋白的结合体),只要是积聚了的p53蛋白,己丧失了监控瘤细胞从G1期进入S期的功能,有促进瘤细胞增殖的作用。
野生型p53蛋白既作用于细胞周期G1时相的监控点又可同时诱导受损DNA细胞凋亡[7]。本文37例有p53蛋白积聚组的TI均数（24.5±26.66）与6例无p53蛋白积聚组的TI均数（23.17±25.3）近似，不存在差异。可能的解释是，积聚了的p53蛋白在丧失了监控瘤细胞从G1期进入S期功能的同时也起不到诱导受损DNA细胞凋亡的功能了。作者实验室李智等38例鼻咽癌中p53阳性瘤细胞百分数与TI无等级相关也证实了这一点[11]。我们知道，野生型p53蛋白可以直接诱导受损DNA细胞凋亡[7]，也可通过上调bax和下调bcl-2而起到促进凋亡的作用[12]。在李智等38例鼻咽癌中，p53阳性瘤细胞百分数分别与bcl-2、bax阳性瘤细胞百分数间均无相关性(Spearman等级相关检验，P值分别为＞0.2和＞0.1)[11]。因此，积聚了的p53蛋白又已丧失了调控bax和bcl-2的表达功能。但是，积聚了的p53蛋白是如何丧失直接诱导受损DNA细胞凋亡的 KagawaS.等的研究说明,野生型p53蛋白有时可以克服p21WAF1/CIP1介导的使细胞停滞在G1时相,却反而诱导细胞凋亡[13]；也就是说,野生型P53蛋白对细胞增殖和凋亡的功能并不一定相互配合。
总之，本文43例鼻咽癌中37例积聚的p53蛋白一方面促进了癌细胞的增殖,另一方面却不影响癌细胞的凋亡,完全失去了野生型p53蛋白应有的在增殖和凋亡中的两大功能。但应该指出的是,最近HarnHJ.等(1998)在50例鼻咽癌标本中所获得的结果却恰恰与本文的结果相反，即p53蛋白的表达与凋亡指数相关而与增殖活性无关[10]。因此，关于p53蛋白积聚与鼻咽癌细胞增殖和凋亡关系还有待进一步研究。
基金项目：本课题受国家自然科学基金(3930200－II)资助
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收稿日期：1999－10－08;修回日期:1999－11－29
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