BHRF1表达对鼻咽癌细胞抗凋亡能力的影响

中华肿瘤杂志 1998年第4期第0卷 基础研究

作者：黄海　潘星华　余龙　孔宪涛　赵寿元 周水淼　李兆基　毛宁辉　郑其平

单位：200433 上海，第二军医大学附属长海医院耳鼻咽喉科(黄海、周水淼、李兆基)；Yale University，USA(潘星华)；上海复旦大学遗传学研究所基因工程国家重点实验室(余龙、赵寿元、毛宁辉、郑其平)；上海第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心(孔宪涛)

　　关键词： 鼻咽肿瘤；BHRF1基因；爱泼斯坦-巴尔病毒；基因表达；细胞凋亡

　　【摘要】　目的　了解EB病毒(Epstein-Barr virus)基因BHRF1(BamHI-H rightward reading frame I)表达对鼻咽癌细胞抗凋亡能力的影响。方法　构建表达BHRF1重组载体并转入鼻咽癌细胞株CNE₂细胞中，以检测癌细胞在⁶⁰Co照射后生物学行为的改变。结果　BHRF1表达可抑制增殖细胞核抗原的表达，促使癌细胞的细胞周期重新分布，癌细胞对辐射的敏感性下降，生存能力增强。结论　BHRF1的表达可增强CNE₂细胞抵抗放射线诱发细胞凋亡的能力。

　　The effect of Epstein-Barr virus gene BHRF1 expression on the apoptotic resistance of nasopharyngeal carcinoma cells　　Huang Hai, Pan Xinghua, Yu Long, et al. Department of Otolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433

　　【Abstract】　Objective　To investigate the effect of EB virus gene BHRF1 expression on the apoptotic resistance of nasopharyngeal carcinoma cell.Methods　Expression vector for BHRF1 was constructed and transfected into nsaopharyngeal carcinoma cell line, CNE₂. The alteration of biologic behaviour of the transfected cells was tested after⁶⁰Co radiation.Results　 BHRF1 expression could inhibit the expression of proliferative cell nuclear antigen, redistribute cell cycle, decrease cell sensitivity to radiation, and enhance their survival ability.Conclusion　It is suggested that BHRF1 expression can increase the apoptotic resistance induced by radiation.

　　【Subject words】　Nasopharyngeal neoplasms　　BHRF1 gene　　Epstein-Barr virus　　Gene expressionApoptosis

　　BHRF1(BamHI-H rightward reading frame I)为EB病毒(Epstein-Barr virus)的一个即早期基因，与原癌基因bcl-2具有部分相同的蛋白序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机理，即有抑制细胞程序性死亡、维持其持续生长的能力。本研究通过构建表达BHRF1的重组载体并转入鼻咽癌细胞株CNE₂细胞中，通过检测转染后癌细胞生物学行为的改变，以探讨BHRF1的作用机制。

材料与方法

　　1.BHRF1重组表达载体的构建：包含644bp的BHRF1开放阅读框的4.7kb的质粒BHRF1-pSG5(英国Dawson教授惠赠)和5.4kb的pcDNA3都含有同向的XbaI和EcoRI酶切位点，将两质粒分别用XbaI和EcoRI(Pharmacia公司)酶切后，回收和纯化BHRF1和pcDNA3片段。T4连接酶连接，转化感受态细胞。

　　2.脂质体介导载体转染：根据操作说明，利用脂质体(Gibcobrl)介导将质粒(重组表达质粒和空载体质粒)转染到CHE₂细胞内。于含400 μg/ml G418的培养液中培养约3周，选择稳定表达新霉素抗性的细胞，并进行扩增。

　　3.Northern杂交检测转染细胞BHRF1的表达：随机引物扩增法(Amersham公司)制备³²P标记BHRF1探针，根据分子克隆实验指南Northern杂交检测转染细胞的BHRF1表达情况^［1］。

　　4.BHRF1整合于宿主基因组DNA的免疫荧光原位杂交定位：利用缺口平移法标记BHRF1-pcDNA3探针(Boerhringer Mannheim公司)，以荧光标记的生物素-抗生物素法(Sigma)检测BHRF1在宿主基因组DNA的整合情况。

　　5.BHRF1表达CNE₂细胞(b-CNE₂)的增殖细胞核抗原表达的改变：以过氧化物酶标记的生物素-抗生素法(福州迈新公司)检测转染前后CNE₂细胞增殖核抗原表达的改变。结果判定及增值指数统计：随机选择视野，计数1 000个癌细胞中的阳性细胞数，每例计数3次，按下列公式计算增值指数：增值指数=阳性细胞数/1 000×100%。

　　6.⁶⁰Co照射对b-CNE₂细胞增殖能力的影响：取3×10³的细胞接种于96孔板，培养24小时后，用8Gy的⁶⁰Co照射，再继续培养10天，每48小时换1次培养液，每天检测每组3个孔的MTT值。

　　7.⁶⁰Co照射对b-CNE₂细胞周期分布的影响：细胞用8Gy的⁶⁰Co照射后，取10⁶细胞/ml照射后即时、24小时和72小时的细胞，用流式细胞仪分析细胞周期的分布。

　　8.原位末端标记法检测b-CNE₂抗辐射诱发凋亡能力的改变：细胞用8Gy的⁶⁰Co照射后，以过氧化物酶标记的生物素-抗生素法(福州迈新公司)检测各组的凋亡指数。凋亡指数计算：凋亡指数=凋亡细胞数/1 000×100%。

　　9.⁶⁰Co照射对b-CNE₂软琼脂集落形成率的影响：用8Gy的⁶⁰Co照射各组细胞，检测细胞集落形成率。

　　10.⁶⁰Co照射对b-CNE₂在裸鼠体内成瘤能力的影响：将裸鼠分为6组，每组3只。各组细胞用8Gy的⁶⁰Co照射后，分别将照射和未照射的3×10⁶个细胞注入裸鼠颈部皮下，观察CNE₂细胞成瘤能力情况。

结果

　　1.表达BHRF1重组载体的酶切鉴定：将BHRF1-pcDNA3质粒用XbaI和EcoRI酶切，凝胶电泳见有大小约0.9kb的片段，提示重组表达载体构建成功。

　　2.b-CNE₂中BHRF1表达的检测：b-CNE₂中BHRF1-mRNA为阳性，而对照细胞为阴性，提示BHRF1已在b-CNE₂细胞中表达。

　　3.BHRF1整合于宿主基因组DNA的免疫荧光原位杂交定位：b-CNE₂为阳性，提示BHRF1-pcDNA3已经整合于癌细胞基因组DNA中。

　　4.b-CNE₂的PCNA表达的改变：PCNA阳性反应呈棕褐色，位于细胞核内。增值指数(±3s)分别为，CNE₂：58.70±7.20；空载体-CNE₂细胞(k-CNE₂)：60.27±10.80；b-CNE₂：18.50±6.15。经统计学处理(t检验)，b-CNE₂的PCNA指数减小(P＜0.01)。

　　5.⁶⁰Co照射对b-CNE₂增殖能力的影响：在照射后的第1天，对照组的细胞数较b-CNE₂组的明显下降，在第2～4天其细胞数继续下降，此后增殖率才逐渐上升。而BHRF1-CNE₂细胞组在照射后两天细胞数下降，从第3天细胞数就开始回升，此后便保持持续的增殖(附图)。

附图　BHRF1表达对CNE₂细胞在辐射后细胞增殖的影响

　　6.⁶⁰Co照射对b-CNE₂细胞周期分布的影响：由附表可见，照射后即时b-CNE₂组的凋亡率＜对照组(P＜0.01)，其S期细胞百分率下降与照射前相比差异无显著性(P＞0.05)；而对照组S期细胞百分率均显著下降(P＜0.01)。照射后24小时，b-CNE₂组的S期细胞百分率上升，G₁和G₂期细胞百分率下降(P＜0.01)。照射72小时后，b-CNE₂组的G₂期细胞百分率上升(0.01＜P＜0.05)；而从照射后的24～72小时，对照组的S期细胞百分率上升的差异无显著性(P＞0.05，χ²检验)。

　　7.原位末端标记法检测b-CNE₂细胞抗辐射诱发凋亡能力的改变：阳性凋亡细胞表现为细胞核内有棕褐色颗粒。凋亡指数分别为，b-CNE₂：31.4±1.3；k-CNE₂：68.5±2.8；CNE₂：71.3±1.9。b-CNE₂凋亡指数低于对照组(P＜0.01, t检验)。

　　8.⁶⁰Co照射对b-CNE₂软琼脂集落形成率的影响：CNE₂、k-CNE₂、b-CNE₂在辐射前集落形成率(%)分别为53.63±11.45、55.50±7.16和53.53±7.86；受辐射后为6.71±3.34、8.42±2.46和28.53±4.35。未经⁶⁰Co照射的3种细胞的集落形成率间的差别无显著性(P＞0.05)；在照射后，b-CNE₂组的集落形成率＞对照组(P＜0.01，χ²检验)。

　　9.⁶⁰Co照射对b-CNE₂在裸鼠体内成瘤能力的影响：在辐射前，CNE₂、k-CNE₂、b-CNE₂细胞在裸鼠体内的成瘤湿重(g)分别为1.28±0.05、1.30±0.03和1.03±0.04；而辐射后为0.25±0.03、0.21±0.03和0.97±0.03。经⁶⁰Co照射后，BHRF1-CNE₂组的肿瘤湿重＞对照组(P＜0.01,χ²检验)。

附表　辐射对b-CNE₂细胞周期的影响

　　讨论

　　放射线能通过损伤细胞的DNA而导致细胞的凋亡。然而，细胞周期各个时期的辐射敏感性是不同的，其敏感性为M＜G₁＜S＜G₂。许多研究结果显示，某些基因如bcl-2表达具有提高NIH3T3抗辐射损伤的效应，过度表达bcl-2的转基因细胞可以提高辐射存活率，并延迟自然凋亡，而抑制bcl-2的表达则可促进肿瘤细胞受辐射后的凋亡^［2，3］。

　　由于BHRF1和bcl-2具有部分相同的蛋白序列和共同的超微结构定位，提示其具有相似的功能和机理，即抑制细胞程序性死亡的能力^［4，5］。通过转基因研究发现，BHRF1表达可抑制细胞的终末分化、并通过抑制细胞凋亡的发生而促进其在无血清情况下生存及抵抗DNA损伤药物的潜力^［6］。

　　本研究表明，BHRF1表达可抑制CNE₂细胞PCNA的表达而调整细胞周期的分布，并影响细胞对辐射的敏感性。BHRF1表达可使处于G₁期的细胞百分率升高，而S期的细胞百分率下降，提示BHRF1表达可抑制CNE₂细胞从G₁期向S期的发展，使处于相对静止的细胞增多。而经⁶⁰Co照射后，BHRF1表达细胞的凋亡率明显＜对照组，S期细胞数回升速度快，提示细胞DNA的合成旺盛，这种现象可能与BHRF1表达所导致的细胞对放射线耐受性增加及促进其对放射线损伤的修复有关。这也解释了BHRF1表达能抑制癌细胞在辐射后凋亡的发生，促进其软琼脂集落形成能力及在裸鼠体内成瘤能力的增强。其可能的意义在于，在EB病毒感染的鼻咽粘膜细胞中，BHRF1表达可增强感染细胞的存活能力，而有利于细胞的恶变，其与鼻咽癌的关系仍有待于进一步的研究。

　　本课题受全军医药卫生基金资助(96Q060)

参考文献

　　1Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Northern杂交. 金冬雁等译. 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：北京科学出版社，1992. 363-372.

　　2Chen M, Quintans J, Fuks Z, et al. Suppression of bcl-2 messenger RNA production may madiate apoptosis after ionizing radiation, tumor necrosis factor α, and ceramide. Cancer Res, 1995, 55: 991-994.

　　3Heller M, Dambaugh T, Kieff E. Epstein-Barr virus DNA. IX. variation among viral DNAs from producer and nonproducer infected cells. J Virol, 1981, 38: 632-648.

　　4Hickish-T. Ultrastructural localization of BHRF1: an Epstein-Barr virus gene product which has homology with bcl-2. Cancer Res, 1994, 54: 2808-2811.

　　5Dawson CW, Eliopoulos AG, Dawson J, et al. BHRF1, a viral homologue of the bcl-2 oncogene, disturbs epithelial cell differentiation. Oncogene, 1995, 9: 69-77.

　　6Tarodi B, Subramanian T, Chinnadurai G. Epstein-Barr virus BHRF1 protein protects against cell death induced by DNA-damaging agents and heterologous viral infection. Virology, 1994, 201: 404-407.

(收稿：1997-10-31　　修回：1998-01-08)