细胞角蛋白基因13在鼻咽癌中的表达研究

中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 临床研究

作者：邱元正　田勇泉　肖健云　陶正德　赵素萍　李桂源

单位：邱元正（湖南医科大学湘雅医院耳鼻喉科，长沙，410008)；田勇泉（湖南医科大学湘雅医院耳鼻喉科，长沙，410008)；肖健云（湖南医科大学湘雅医院耳鼻喉科，长沙，410008)；陶正德（湖南医科大学湘雅医院耳鼻喉科，长沙，410008)；赵素萍（湖南医科大学湘雅医院耳鼻喉科，长沙，410008)；李桂源（湖南医科大学肿瘤研究所)

　　关键词： 鼻咽肿瘤；细胞角蛋白基因13；基因表达；免疫组织化学；Northern杂交

　　【摘要】　目的　探讨细胞角蛋白基因13(Cytokeratin 13, CK13)在人鼻咽癌(NPC)中的表达。方法　应用免疫组化检测了40例NPC组织和8例慢性鼻咽炎(CINE)组织中CK13蛋白水平的表达，同时应用Northern杂交对其中32例NPC和8例CINE组织进行了mRNA水平检测，并分析了CK13表达与NPC临床特征的关系。结果　在NPC中，CK13在蛋白质水平和mRNA水平均较CINE显著降低(P＜0.01)，且CK13表达与NPC颈淋巴结转移有显著相关性(P＜0.05)，与肿瘤的T分期无显著相关性(P＞0.05)。结论　CK13基因的表达可能与NPC组织分化以及颈淋巴结转移有关。

Cytokeratin 13 gene expression in human nasopharyngeal carcinoma

QIU Yuanzheng, TIAN Yongquan, XIAO Jianyuan, et al.

　　（Department of Otolaryngology, Xiang Ya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008, China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the possible pathogenetic role of cytokeratin 13 (CK13) gene expression in human nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods　Tissue samples taken from a total of 40 cases of NPC and 8 cases of chronic inflammation of nasopharyngeal epithelium (CINE) were immunohistochemically studied for CK13 protein expression. Northern blot hybridization was used to detect CK13 gene at mRNA level in 32 of the 40 NPC and in 8 CINE cases. Correlations of CK13 expression with the clinical features of NPC were also investigated.Results　Significantly stronger immunoreactivity for CK13 protein was shown in CINE than in NPC tissues (P＜0.01), so did it at mRNA levels. Significantly higher CK13 expression was demonstrated in patients with cervical lymph node metastasis, as compared to those without (P＜0.05). However, no significant correlation between CK13 expression and clinical staging of the disease.Conclusion　The decreased expression of CK13 in NPC suggests that differentiation disturbance of the nasopharyngeal epithelium might play a role in the pathogenesis of NPC.

　　【Subject words】　Nasopharyngeal neoplasms;　Cytokeratin 13;　Gene expression;　Immunohistochemistry;　Northern blot hybridization

　　目前国内外对鼻咽癌(NPC)的病因、遗传易感性和癌变机理进行了较广泛的研究，但是，其发病的确切分子机制至今仍未完全阐明。最近，湛凤凰等^［1］报道细胞角蛋白基因13(Cytokeratin 13, CK13)在人胚鼻咽上皮组织及鼻咽癌上皮细胞株 HNE₁中呈差异性表达，前者呈强阳性表达，后者表达显著下调。为进一步探讨该基因在NPC发生中的作用，我们采用免疫组化和Northern杂交技术对人NPC活检组织中CK13的表达情况进行检测，并分析其与NPC临床特征的关系。

　　材料与方法

　　1.组织标本：选择自1997年12月至1998年5月在我科肿瘤专科门诊初诊的NPC患者40例。男 29例，女 11例；年龄为18～70岁(平均年龄48.6岁)；经病理证实均为低分化鳞癌。8例恐癌患者，男6例，女2例；年龄为18～65岁(平均年龄42.7岁)；经病理证实均为慢性鼻咽炎(CINE)。全部标本取出后分装并保存在液氮中。

　　2.免疫组化SP法染色：具体步骤按SP试剂盒（福建迈新公司）说明书进行。

　　3.总RNA的抽提：具体方法按Trizol^TM试剂盒 (Gibco BRL公司)说明书进行。

　　4.CK13探针的制备：cDNA合成方法按cDNA合成试剂盒(Promega公司 )说明书进行。通过微软公司PC-R Designer软件自行设计引物，序列如下：正义引物(P1)：5′-CTG-GTG-GCT-TTG-TTG-ACT-TT-3′；反义引物(P2)：5′-ATC- TCT-GTC-TTG-CTG-GTC-TGA-3′。扩增片段大小为706 bp，引物由上海细胞所赛尔生物工程公司合成。

　　PCR扩增及其产物的回收：在扩增CK13同时，以 GAPDH引物为内对照。50 μl反应液中含5 μl RT产物，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L Tris HCl，200 μmol/L dNTPs，引物P₁和P₂分别为20 pmol/L，2.5 U Taq酶(Promega公司)。上层覆盖石蜡油，在DNA扩增仪(Promega公司)上进行如下循环：94℃ 1 min，55℃ 50 s，72℃ 50 s，35个循环，72℃延伸10 min。应用Wizard^TM PCR Prep树脂纯化PCR产物，具体方法按说明书进行。

　　探针的标记：取纯化的PCR产物80 ng，用［α-³²P］dCTP(北京亚辉公司)和随机引物试剂盒(Promega公司)标记探针。测定探针的比放射活性应＞1×10⁸计数·min^-1.μg^-1。

　　5.Northern杂交：取样品NPC和CINE中RNA 2份，各20 μg，在1.0%甲醛变性琼脂糖凝胶上电泳，转尼龙膜，杂交、洗膜后再显影、定影。每张膜分别与CK13和GAPDH探针杂交。

　　6.结果判断：CK13阳性反应为细胞胞浆染成棕黄色，采用双盲法在每张切片中选取有代表性的区域，在高倍镜下（10×40）计数1 000个细胞中的阳性细胞数，计算出百分数。CK13蛋白的表达强度分为3级：阴性：0%；弱阳性：＜50%；强阳性：＞50%。用美国UVP GDS-8000型分析系统对Northern杂交影像进行扫描分析，以GAPDH为内对照，CK13基因相对强度为某样品CK13扫描值与其内对照扫描值的比。比值＞0.5为强阳性，比值＜0.5为弱阳性，比值＝O为阴性。

　　7.统计学方法：以确切计算概率法进行统计。

　　结果

　　一、CK13基因在NPC和CINE组织中的表达

　　1.CK13基因蛋白的表达：免疫组化检测发现，40例NPC组织中，12例(30.0%)CK13蛋白呈强阳性信号，17例(40.2%)呈弱阳性信号，11例(29.8%)未见阳性信号；8例CINE均呈强阳性信号。阳性信号为桔黄色，定位在细胞浆内(表1，图1～3)。在NPC和CINE组织中，CK13基因蛋白表达的差异有显著性(P＜0.01)。

　　图1 CK13基因蛋白在CINE组织中的表达.图1a:SP染色 ×200;图1b:SP染色 ×400 图2 CK13基因蛋白在NPC中的强表达SP染色 ×400 图3 CK13基因蛋白在NPC组织中的弱表达 SP染色 ×400

　　2.CK13基因mRNA的表达：Northern杂交检测发现，在32例NPC组织中，11例(34.4%)呈强阳性信号，12例(37.5%)呈弱阳性信号，9例(28.1%)未见信号；8例 (100%)CINE均呈强阳性信号(表2，图4)。在NPC和CINE组织中，CK13基因mRNA表达差异有显著性(P＜0.01)。

表1　NPC和CINE中CK13基因蛋白的表达

　　^*弱阳性或阴性

表2　NPC和CINE组织中CK13基因mRNA的表达

　　^*弱阳性或阴性

1，2，4，5，6，7：NPC；3，8：CINE

4　CK13基因在NPC和CINE组织中的表达

　　二、CK13基因表达与NPC临床特征的关系

　　CK13基因在NPC组织中的表达与NPC颈淋巴结转移明显相关(P＜0.05)，而与患者的原发灶T分期无关(P＞0.05，表3)。鼻咽癌分期按1992年福州会议制订的TNM分期方案进行分期。淋巴结转移的判断标准为在颈上深可扪及≥2.0 cm的肿大淋巴结，质地较硬，活动度较差。本研究中的N0

表3　32例NPC临床病理特征与CK13 mRNA表达的关系

　　^*弱阳性或阴性包括颈部未扪及肿大淋巴结和颈部扪及＜2.0 cm的肿大淋巴结(以排除颈部转移的假阳性)。讨论

　　CK13属Ⅰ型细胞角蛋白，它是鳞状上皮转化及分化的标志。近年来发现CK13基因的改变在肿瘤的发生、发展中起着一定作用。部分学者运用免疫组化法发现，少数来自涎腺、鼻腔和鼻窦的内翻性乳头状瘤中，CK13基因的表达较其正常的组织明显增强^［2，3］。口腔鳞状细胞癌CK10和CK13的表达，较鳞状细胞肺癌增强^［4］。而内翻性乳头状瘤和口腔鳞状细胞癌均属于分化程度高的肿瘤组织，这提示CK13基因在分化程度高的肿瘤组织中呈高表达。我们应用免疫组化的方法对40例NPC组织进行了CK13基因蛋白的表达检测，结果显示 ，70.0%(28/40)NPC组织中CK13基因蛋白表达明显下调；同时运用Northern杂交的方法对其中的32例(另8例由于抽提的RNA质量问题而弃去)进行CK13基因mRNA表达的检测，发现65.6%(21/32)的NPC组织中CK13基因的mRNA表达呈弱阳性信号，甚至无信号。免疫组化和Northern杂交的结果显示，尽管在个别NPC组织中CK13 mRNA 和CK13蛋白的表达强度不甚一致，但在绝大多数标本中，CK13基因在这两个水平上的表达强度基本上是互相平行的，提示NPC组织细胞中CK13基因表达水平的下调，可能来自于对该基因转录或转录以上水平的调节。上述两种方法发现，CK13基因在NPC组织中表达下调或消失的频率达65.6%，而NPC的临床病理特点是大多数为低分化鳞癌，这又提示在分化程度低的肿瘤组织中，CK13基因表达减弱，从而推测CK13基因的表达可能与肿瘤的分化程度相关。肿瘤细胞的分化高低决定肿瘤恶性程度，因此，我们可以通过转染CK13基因入肿瘤细胞，或寻找能够使肿瘤细胞中CK13基因上调的物质，达到促进肿瘤细胞的分化，从而降低肿瘤的恶性程度。这为肿瘤的分化治疗提供了理论依据。至于CK13基因在NPC中表达下调的机制，我们认为可能与其甲基化程度增高有关，但其确切机制仍在研究之中。

　　随着对CK13基因研究的深入，人们发现，不同肿瘤组织中CK13基因的表达，与其临床特征的关系也不甚一致。Bommol等^［5］发现CK13基因的改变与宫颈癌患者无淋巴结转移以及宫颈癌患者的复发无关，而与宫颈癌的肿瘤分期以及有淋巴结转移的患者的预后有关，即有淋巴结转移的宫颈癌患者，CK13基因表达高的预后好，反之，预后差。Sarbia等^［6］发现，尽管在食管中基底样鳞状细胞癌CK13基因的表达较鳞状细胞癌弱，但CK13的表达与肿瘤分期、肿瘤大小、血管侵袭、淋巴管侵袭、神经的受累以及生存率均无关。本研究CK13基因的表达与NPC患者T 分期无关，而与NPC患者的颈部淋巴结转移有关。这与Bommol等^［5］报道的结果不一致，可能是由于CK13基因的表达存在组织特异性，但其确切的分子机制还有待于进一步研究。至于NPC组织中CK13基因的改变是否与患者的预后有关，我们仍在随访之中。

　　基金项目：国家863高技术计划经费资助项目(102-10-01-05)

　　参考文献：

　　［1］　湛凤凰，江宁，曹利，等.cDNA代表性差异分析法分离鼻咽癌上皮细胞株HNE₁表达差异cDNA序列的初步研究.中华医学遗传学杂志，1998，15：341-344.

　　［2］　Sousa SO, Sesso A, Araujo NS, et al. Inverted ductal papilloma of minor salivary gland origin: morphological aspects and cytokeratin expression. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1995,252：370-373.

　　［3］　Plinkert PK, Ruck P, Baumann I, et al. Inverted papilloma of the nose and paranasal sinuses-diagnosis, surgical procedure and studies of cytokeratin profile. Laryngorhinootologie, 1997,76：216-224.

　　［4］　Hamakawa H, Bao Y, Takarada M, et al. Cytokeratin expression in squamous cell carcinoma of the lung and oral cavity: an immunohistochemical study with possible clinical relevance. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 1998,85：438-443.

　　［5］　Bommol PF, Kenemans P, Helmerhorst TJ, et al. Expression of cytokeration 10, 13 and involucrin as prognostic factors in low stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Cancer, 1994,74：2314-2320.

　　［6］　Sarbia M, Verreet P, Bittinger F, et al. Basaloid squamous cell carcinoma of the esophagus: diagnosis and prognosis. Cancer, 1997,79：1871-1878.

收稿日期：1999-06-03