鼻咽癌组织中浸润淋巴类细胞对瘤细胞凋亡的影响

肿瘤 2000年第5期第20卷 临床研究

作者：李智　宗永生

单位：李智　宗永生（广州中山医科大学病理学教研室　广州510089）

关键词：鼻咽肿瘤/病理学；肿瘤浸润性淋巴细胞；凋亡

　　摘要：目的　研究未经治疗的鼻咽癌组织中浸润淋巴细胞对癌细胞凋亡的影响。方法　中山医科大学所属病理科38例未经治疗的鼻咽癌活检组织采用末端标记细胞死亡检测法(TUNEL，TdT-mediated dUTP nick end labeling)计量每5，000个癌细胞中凋亡的癌细胞数——癌细胞凋亡计数(Apoptosis Count, AC)，采用LSAB免疫组化法检测鼻咽癌组织中浸润的反应性T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞和单核/巨噬细胞。各种淋巴类细胞指数以高倍视野下的细胞平均数表示，即反应性T细胞指数(T cell index,TCI), B细胞指数(B cell index, BCI)，树突状细胞指数(dendritic cell index, DCI)和单核/巨噬细胞指数(Monocytes/macrophages index, MMI)。结果　(1)癌细胞凋亡计数(AC)在38例未经治疗的鼻咽癌组织中波动较大，其均数为13.01±13.21/5，000癌细胞。(2)癌细胞凋亡计数AC与TCI呈正相关，与BCI和DCI不相关。(3)AC与MMI呈正相关。结论　(1)浸润于鼻咽癌组织中反映机体细胞免疫功能的反应性T细胞，能够影响瘤细胞的凋亡；(2)单核/巨噬细胞指数MMI与癌细胞凋亡计数AC呈正相关的结果说明浸润的单核/巨噬细胞也可影响癌细胞的凋亡，但也有可能部分癌细胞凋亡的后果；(3)与机体体液免疫功能有关的B细胞和树突状细胞对鼻咽癌细胞的凋亡无直接影响作用。

　　中图分类号：R739.6　　文献标识码：A

　　文章编号：1000-7431(2000)05-0343-03

EFFECT OF TUMOR INFILTRATING LYMPHOID CELLS ON NEOPLASTIC CELL APOPTOSIS IN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA

LI Zhi,ZONG Yong-sheng.

　　(Department of Pathology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089,China)

　　Abstract：Objective　To investigate the effect of tumor infiltrating lymphoid cells on neoplastic cell apoptosis in untreated nasopharyngeal carcinomas (NPCs).Methods　38 nasopharyngeal biopsy samples from untreated NPC patients were collected. TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling) method was used for quantifying the neoplastic cell apoptotic count (AC, number of apoptotic cells per 5000 neoplastic cells). LSAB immunohitochemistry was adopted to detect the reactive T-cells, pan B-cells, monocytes/macrophages and dendritic cells. The amount of various infiltrating lymphoid cells was also indicated (cell no. high power view) termed reactive T-cell index (TCI), pan B-cell index (BCI), monocyte/macrophage index (MMI), and dendritic cell index (DCI) respectively. Results　(1)The AC was varied greatly from case to case in untreated NPSs, the mean value being 13.01±13.21/5,000.(2)The AC was positively correlated with TCI and MMI, but not with BCI nor DCI. Conclusion　(1) The host cell immunity represented by tumor infiltrating reactive T-lymphocytes is able to influence the NPC cell apoptosis. (2) A positive correlation between AC and MMI indicates that the infiltrating monocytes/macrophages might principallyt be an apoptosis-inducer or might be a consequence of apoptotic debris. (3) The infiltrating B-lymphocytes representing host humoural immunity and antigen presenting dendritic cells as well do not directly influence upon neoplastic cell apoptosis.

　　Key words：Nasopharyngeal neoplasm;　Tumor infiltrating lymphocyte;　Apoptosis

　　淋巴细胞浸润是鼻咽癌的一个特征性的病理学表现。浸润淋巴细胞的数量与预后有关^［1，2］。同时在鼻咽癌肿瘤组织中也可发生瘤细胞的凋亡^［3，4］。在多种浸润淋巴细胞类型中，是何种细胞对瘤细胞的凋亡直接相关，又是通过何种途径导致细胞凋亡?本文的目的就是通过对浸润淋巴细胞与瘤细胞凋亡关系的研究，探讨其相关机制，为临床鼻咽癌患者进行有效的生物治疗提供理论线索。

　　材料与方法

　　一、材料　38例治疗前的鼻咽癌活检组织收集自中山医科大学所属病理科，标本经10 %中性福尔马林液固定，石蜡包埋、切片。

　　二、原位细胞死亡检测　采用Boehringer Mannheim公司末端标记试剂盒(TdT-mediated dUTP nick end labeling kit, TUNEL No.1684809)检测鼻咽癌组织中的原位凋亡细胞。BCIP/NBT显色，1%甲基绿复染，阳性信号呈紫蓝色。以细胞凋亡计数(Apoptosis Count,AC)，即每5 000个癌细胞中凋亡的癌细胞数，作为鼻咽癌组织中细胞凋亡的量化指标。

　　三、免疫组化染色　采用DAKO公司LSAB(labeled streptavidin biotin)免疫组化试剂盒(DAKO K0618)。检测鼻咽癌组织中浸润的反应性T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞。DAB显色，1%甲基绿复染。所有阳性信号均位于胞浆和胞膜胞核。第一抗体的应用见表1。

表1　第一抗体性质、来源、抗原修复方法和工作浓度

　　MW-CB：Microwave treatment using citrate buffer.

　　各种标记的TILs在高倍视野下(10×40)的平均数(至少随机观察10个视野)分别称为反应性T细胞指数(TCI)，B细胞指数(BCI)，单核/巨噬细胞指数(MMI)。和树突状细胞指数(DCI)。

　　说明(2)

图6　　鼻咽癌组织中的浸润细胞和凋亡细胞　A.凋亡细胞和凋亡小体(TUNEL ×100)

　　B.反应性T淋巴细胞(UCHL₁×100)　C.B淋巴细胞(L₂₆×100)

　　D.单核/巨噬细胞(Lysozyme×100)

　　结　　果

　　38例未经治疗的鼻咽癌在组织学上均属非角化性癌。在TUNEL染色下，凋亡的癌细胞可表现为点状的凋亡小体或核周边呈紫蓝色的凋亡细胞(见插页第Ⅱ页图6A)，其数量不等，分布不均，38例组织中平均癌细胞凋亡计数AC为13.01±13.21/5 000癌细胞。组织中各种被标记的浸润淋巴类细胞，包括反应性T细胞(见插页第Ⅱ页图6B)、B细胞(见插页第Ⅱ页图6C)、单核/巨噬细胞(见插页第Ⅱ页图6D)和树突状细胞在组织中分布极不均匀，且在各病例之间的波动也颇大。其指数TCI平均分别为：43.71±29.31/高倍视野，BCI：15.09±16.96/高倍视野，MMI：41.35±29.74/高倍视野，DCI：23.6±23.8/高倍视野。

　　38例鼻咽癌组织中的TCI、BCI、MMI和DCI分别与AC作Spearman等级相关检验，统计结果显示，癌细胞凋亡计数AC与TCI呈正相关，(r=0.347，P＜0.05)，两者有较明显的相关趋势；AC与BCI无相关 (r=-0.024，P＞0.05)，与DCI亦无相关性(r=0.189，P＞0.05)；但AC与MMI存在着正相关关系(r=0.476，P＜0.05)。

　　讨　　论

　　淋巴细胞浸润是鼻咽癌的一个主要形态学特征，但浸润淋巴细胞数量却在各病例间存在着较大的差异^［1，2］。说明不同的鼻咽癌之间存在着免疫反应的差异性。细胞介导的机体免疫反应可以导致肿瘤细胞的死亡^［5］，治疗前鼻咽癌组织中确实存在着凋亡的瘤细胞，并且，瘤细胞凋亡的数量在不同病例间的差异也颇大。那么，鼻咽癌组织中的凋亡瘤细胞数量与浸润的淋巴细胞是否有联系?结果显示，鼻咽癌组织中的AC与TCI在不同病例间的变化很大，但存在着正相关关系(P＜0.05)。在我们研究中用以标记浸润T细胞的单克隆抗体是UCHL1，这是一种可用于石蜡切片，识别CD45的180KD异构体的记忆/效应T细胞标记物^［6］。治疗前鼻咽癌组织中浸润的反应性T细胞(而非所有的T细胞)，可能影响癌细胞的凋亡。

　　T细胞是通过其受体来识别由抗原呈提细胞所呈提的不同类型抗原^［7］。每一T细胞群通过抗原特异性T细胞受体(TCR)识别特殊的细胞抗原^［5，7］。肿瘤特异性T细胞由肿瘤细胞本身所产生的肿瘤特异性抗原的刺激形成。由于鼻咽癌与EB病毒感染的关系十分密切，EB病毒编码产物是形成肿瘤特异性抗原的首选因素。由于EBV特异性细胞毒性T细胞［EBV-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL)］不能识别EBNA1，所以目前集中对EB病毒编码的产物，如LMP-1、LMP-2、LMP-2A、LMP-2B、ZEBRA进行研究^［8］。作者认为，对EB病毒蛋白(特别是LMP1)的独特受体的T细胞，在MHC-Ⅰ协同作用下，可以诱导瘤细胞凋亡。至于T细胞通过何种途径使瘤细胞凋亡，是一个很复杂的过程，还需进一步深入研究。

　　我们的研究结果还表明，AC与MMI也呈正相关，提示浸润在治疗前鼻咽癌组织中的单核/巨噬细胞也具有诱发瘤细胞凋亡的作用。巨噬细胞可以产生多种细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，可以与肿瘤细胞表面的TNF受体相结合，启动细胞凋亡的信号传导途径，最终导致瘤细胞凋亡^［5］。此外，巨噬细胞还能处理被吞噬的抗原，如EB病毒编码的缺失型LMP-1蛋白，并将处理形成的特异性多肽呈提给T细胞。Khanna R等(1998)的实验研究表明，即便是NPC瘤细胞也能处理LMP-1抗原，并将其呈提给CTL，形成LMP-1特异性CTL^［9］。这些接受特异性呈提抗原刺激的T细胞将会发生TCR基因重排而变为肿瘤特异性的CTL^［5，7］。因此，但鼻咽癌组织中浸润的单核/巨噬细胞可能还起着辅助肿瘤细胞凋亡的作用。同时通过自身的某些毒性代谢产物和蛋白溶解酶等溶解肿瘤细胞，吞噬凋亡的细胞^［5］。但鼻咽癌组织中由于癌细胞凋亡后可部分吸引巨噬细胞的吞噬，因此，本研究中得出的癌细胞凋亡计数与单核/巨噬细胞指数呈正相关的结果也可能是癌细胞凋亡所引起的后果。

　　研究结果AC与BCI没有相关性，说明浸润于鼻咽癌组织中的B淋巴细胞可能对癌细胞的凋亡没有直接的影响作用。同样，AC与DCI之间也无相关性，提示树突状细胞在鼻咽癌细胞的凋亡过程中也不起主要作用。树突状细胞来源于血管外周组织，而非单核巨噬细胞系统^［10］，其表面有大量的MHC-Ⅱ类分子^［11］，与机体体液免疫的关系密切。因此，浸润于鼻咽癌组织中的B淋巴细胞和树突状细胞与鼻咽癌细胞的凋亡并无密切的关系，因为体液免疫并非导致肿瘤细胞死亡的主要因素^［5］。

　　本课题为国家自然科学基金资助项目(批准号：39730200-Ⅱ)

　　作者简介：李智，男，博士，讲师。

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(收稿日期：2000-03-10)