细胞周期对Fas/APO-1在前列腺癌细胞系PC-3M中表达的影响

中华泌尿外科杂志 1999年第4期第20卷 论　　著

作者：李宏军　俞莉章　梁云燕　王代树　郭应禄

单位：李宏军　俞莉章　郭应禄（100034 北京医科大学第一医院泌尿外科，北京医科大学泌尿外科研究所）；梁云燕　王代树（北京肿瘤研究所）

　　关键词： 前列腺肿瘤；癌；细胞周期

　　【摘要】　目的　研究细胞周期对PC-3M细胞表面Fas/APO-1蛋白表达的影响。　方法　采用直接免疫荧光流式细胞术对前列腺癌细胞系PC-3M未同步化的细胞，及经改良的笑气阻断及TdR双阻断方法同步化的不同细胞周期细胞表面Fas/APO-1表达情况进行检测。　结果　未同步化的PC-3M细胞Fas/APO-1表达阳性率为34.20%；PC-3M细胞系不同细胞周期的细胞表面Fas/APO-1表达明显不同，以S期最高达85.05%，G₁及M期较低，分别为3.32%和4.95%。　结论　细胞周期对细胞表面Fas/APO-1的表达情况有明显影响。深入研究细胞周期对肿瘤细胞Fas/APO-1表达情况的影响，对于采用Fas/APO-1系统途径治疗恶性肿瘤有重要意义。

Influence of cell cycle on the expression of Fas/APO-1

　　in the cells of PC-3M cell line

LI Hongjun,YU Lizhang,LIANG Yunyan,et al

　　Institute of Urology,Beijing Medical University,Beijing 100034

　　【Abstract】　Objective　To determine the influence of cell cycle on the expression of Fas/APO-1 in PC-3M cell line.　Methods　With direct-immunofluorescence flow cytometry,expression of Fas/APO-1 in unsynchronized and synchronized cells of PC-3M cell line derived from non-androgen dependent prostatic carcinoma was detected.　Results　Unsynchronized cells of PC-3M cell line expressed Fas/APO-1 in 34.20%;expression levels of Fas/APO-1 in the cells of PC-3M in different cell cycles being significantly different,mainly expressed in S phase (positive rate reached 85.05%),and limitedly expressed in G₁ and M phases (positive rate was 3.32% and 4.95% respectively).　Conclusions　Cell cycle would influence the expression level of Fas/APO-1 significantly,and might have some clinical relevance.

　　【Key words】　Prostatic neoplasms　　Carcinoma　　Cell cycle

　　Fas/APO-1分子是近年发现的细胞凋亡信号受体，广泛表达于正常组织及多种肿瘤细胞上，当与其特异性配体(FasL)结合后，可以传导凋亡信号，诱导Fas/APO-1所在细胞的凋亡，该途径在治疗恶性肿瘤中的作用引起了研究者们的广泛重视。通过Fas/APO-1途径诱导凋亡作用的先决条件是细胞必须表达正常的Fas/APO-1，并且要达到一定强度^［1］，因而研究Fas/APO-1的表达情况及其影响因素至关重要。

　　处于不同细胞周期内的细胞在形态、结构及功能等方面具有明显的差异，是否对细胞表面Fas/APO-1的表达有所影响尚不清楚。我们采用笑气(N₂O)及胸腺嘧啶(TdR)双阻断方法对非雄激素依赖型的人类前列腺癌细胞系PC-3M细胞进行同步化处理，并检测其Fas/APO-1的表达情况。

　　材料与方法

　　一、细胞和培养条件

　　非雄激素依赖型前列腺癌肿瘤细胞系PC-3M取自本所免疫室，PC-3M是PC-3细胞系的一个变异体^［2］，细胞系的建株及其特性见文献［3］。采用RPMI-1640含有16% FCS，2mmol/L谷氨酰胺的培养液培养于37℃的CO₂孵箱内。培养细胞复苏后4周内用于实验研究。

　　二、细胞同步化方法

　　采用改良的笑气阻断及TdR双阻断方法进行M、G₁及S期的细胞同步化^［4］。

　　1.M期细胞的同步化：将PC-3M细胞按常规接种于培养瓶中，当细胞进入指数生长期时加入过量的TdR(终浓度2.5mmol/L)，经17小时培养，洗脱解除阻断3～5小时。将瓶盖扭松，放入高压罐，罐内充入400ml的CO₂气体，迅速加盖密封，从进气口缓慢通入笑气，0.5小时使罐内压力升至5.5kg/cm²，关闭阀门，将罐放入37℃恒温培养箱，经17小时后在通风橱内放气减压，取出培养瓶轻轻振荡，M期细胞脱落悬浮，收集待用。

　　2.G₁期细胞的同步化：收集M期细胞接种于培养瓶中，37℃培养，经4～5小时，细胞进入G₁期，用0.02% EDTA消化并收集细胞，用于检测。

　　3.S期细胞的同步化：将上述G₁期细胞中加入过量的TdR(终浓度2.5mmol/L)，经17小时培养，洗脱解除阻断3～5小时，得到S期细胞，用0.02% EDTA消化并收集细胞，用于检测。用台盼蓝染色检测细胞的存活性，所有样本细胞存活率均在95%以上。

　　三、流式细胞术检测细胞表面Fas/APO-1的表达

　　采用直接免疫荧光法流式细胞术检测。所用FITC标记的小鼠抗人IgG₁，κ DX2抗体。采用Becton Dickinson流式细胞仪和CELL Quest配对软件分析。死细胞及细胞碎片直接从细胞窗去除，每份标本分析10⁴个细胞，细胞表面荧光指数(SFI)为特异Fas/APO-1抗体染色的平均荧光强度值除以同型阴性对照抗体的平均荧光强度值。阳性细胞百分率直接从门控直方图中计算。

　　结　　果

　　流式细胞实验证明Fas/APO-1对胰酶处理比较敏感^［5］，因而本实验所有贴壁细胞均用0.02% EDTA消化。

　　直接免疫荧光流式细胞术检测结果表明，未同步化的PC-3M细胞Fas/APO-1表达阳性率为34.20%，SFI值为4.10；同步化的PC-3M细胞系不同细胞周期的细胞表面Fas/APO-1的表达明显不同，以S期最高，阳性率达85.05%，并且明显属于不同的细胞亚群，G₁及M期均较低，分别为3.32%和4.95%，而SFI值分别为33.14、1.20和1.52。

　　讨　　论

　　目前细胞同步化方法有多种，我们采用的笑气与过量胸腺嘧啶双阻断方法同步细胞具有同步率高，方法简便等优点，缺点是需要特殊仪器^［4］。本方法可以有效地将G₂与M期细胞分离开来，M期细胞的同步化程度可高达90%以上^［4］。

　　Fas/APO-1是一种细胞表面糖蛋白，通过特异性抗体或配体触发Fas/APO-1信号途径，可以导致许多种类细胞的凋亡作用，凋亡信号的传导是通过寡聚化的Fas/APO-1受体的死亡功能区与一系列的胞浆内信号分子相互作用来实现的，这些信号分子将受体偶联到半胱氨酸蛋白酶家族(caspases)上，Caspases在所有的细胞中都以无活性的前体形式存在，可以为细胞死亡信号所活化，参与Fas/APO-1信号途径触发的细胞凋亡作用^［6］。到目前为止，已经发现十余种Caspases的存在，其生理作用有待深入研究。通过诱导凋亡作用，Fas/APO-1可以作为一种肿瘤形成的抑制因素；而Fas/APO-1信号的灭活或丧失，可因不能进行凋亡作用而导致异常细胞的存活^［7］。人类恶性肿瘤细胞系对Fas/APO-1抗体(Fas Ab)或配体(FasL)触发凋亡信号的敏感性主要依赖于细胞表面Fas/APO-1的表达水平^［8］。因而，深入研究细胞表面Fas/APO-1表达的调控因素是十分必要的。

　　不同细胞周期内的细胞在形态、结构和功能等方面存在许多差异，其细胞表面某些基因表达的产物也有所不同。本研究结果证明了这一点。Fas/APO-1明显高表达于S期的PC-3M细胞，临床可以用来设计通过Fas/APO-1途径对异常增殖性疾病，尤其是恶性肿瘤的临床治疗方案。

　　PC-3M是非雄激素依赖型前列腺癌，对于抗雄激素治疗不敏感，这类患者的治疗比较困难，寻找有效的治疗途径十分必要。Fas/APO-1系统途径由于其独特的诱导凋亡作用，在恶性肿瘤治疗中有重要的应用前景。可以按照细胞周期局部给以抗Fas/APO-1治疗，也可以通过某些细胞因子或药物使肿瘤细胞达到特定的细胞周期(高表达Fas/APO-1)内，局部应用Fas/APO-1抗体或FasL来恶性疾病进行生物治疗。这项应用在抗Fas/APO-1途径导致肿瘤消退的裸鼠动物模型中得到了证实^［9］。

　　参考文献

　　[1]　李宏军，俞莉章，郭应禄.Fas系统在肿瘤研究中的应用.中华外科杂志，1997，35∶59-62.

　　[2]　Kozlowski JM,Fidler IJ,Campbell D,et al.Metastatic behavior of human tumor cell lines grown in the nude mouse.Cancer Res,1984,44∶3522-3529.

　　[3]　Kaighn ME,Narayan S,Ohnuki Y,et al.Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).Invest Urol,1979,170∶16-23.

　　[4]　梁云燕，王代树，方家椿，等.一种高效率细胞同步化方法的改良与运用.细胞生物学杂志，1991，13∶137-140.

　　[5]　Weller M,Frei K,Groscurth P,et al.Anti-Fas/APO-1 antibody-mediated apoptosis of cultured human glioma cells.J Clin Invest,1994,94∶954-964.

　　[6]　Alinemri ES,Livingston DJ,Nicholson DW,et al.Human ICE/CED-3 protease nomemclature.Cell,1996,87∶171.

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　　[8]　Owen-Schaub LB,Radinsky R,Kruzel E,et al.Anti-Fas on nonhematopoietic tumors:levels of Fas/APO-1 and bcl-2 are not predictive of biological responsiveness.Cancer Res,1994,54∶1580-1586.

　　[9]　Coney LR,Daniel PT,Sanborn D,et al.Apoptotic cell death induced by a mouse-human anti-APO-1 Chinmeric antibody leads to tumor regression.Int J Cancer,1994,58∶562-567.

(收稿：1998-03-02　修回：1998-10-20)