前体药物甲氨喋呤-α-肽对前列腺癌的作用

　　第四军医大学学报1999年第20卷第2期

　　郝晓柯　张盈华　施溥涛　殷缨　韩云龙

　　摘　要　目的：研究前列腺癌的导向酶-前体药物疗法（ADEPT），在体内外观察前体药物甲氨喋呤-α-肽对前列腺癌的作用.方法：用前体药物甲氨喋呤-α-苯丙氨酸(MTX-α-Phe)和甲氨喋呤-α-精氨酸(MTX-α-Arg)对前列腺癌细胞PC-3，PC-3m进行了细胞毒性及细胞动力学分析，并对前列腺癌荷瘤裸鼠模型行肿瘤生长抑制的观察.结果：体外细胞毒性试验，前体药物对任何细胞均无毒，但MTX-α-Phe 经羧肽酶-A（CP-A）水解后，其细胞毒性大于前体药物约1 000倍，对前列腺癌细胞有显著抑制作用，细胞动力学分析肿瘤细胞生长明显受阻于S期. 动物模型体内试验，经抗人精浆蛋白单克隆抗体导向的羧肽酶-A-MTX-α-Phe ADEPT治疗组，肿瘤生长明显抑制，动物生活质量优于单用MTX组.结论：MTX-α-Phe+CP-A是一理想的前列腺癌的ADEPT对.

　　关键词：前体药物　前列腺肿瘤　导向　治疗

　　0　引言

　　抗体导向的酶-前体药物疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT)是近年来肿瘤抗体导向治疗研究中一项引人注目的新进展^［1,2］. 它有望解决导向治疗中肿瘤异质性、药物在肿瘤组织内浓度过低及损伤正常组织细胞等问题^［3,4］. 目前，此研究国外正处于发展与完善阶段，但国内未见报道. 我们合成了用于治疗前列腺癌的前导药物:甲氨喋呤-α-肽衍生物，并对前列腺癌细胞及动物模型行体内外试验，取得了较满意的效果.

　　1　材料和方法

　　1.1　主要试剂及细胞　甲氨喋呤(MTX)为上海第十二制药厂产品(药品批准文号沪卫准字0391-012)，甲氨喋呤-α-肽衍生物：甲氨喋呤-α-苯丙氨酸(MTX-α-Phe)和甲氨喋呤-α-精氨酸(MTX-α-Arg)由本室合成，经高效液相色谱测定为单峰，激光质谱仪测定其分子量与理论值一致^［5］. 羧肽酶-A（Carboxypeptidase A Type Ⅰ，CP-A)为Sigma公司产品，人前列腺癌细胞株PC-3(低转移性)和PC-3m(高转移性)，由北京医科大学病理教研室从美国引进，在RPMI 1640完全培养基（内含150 mL/L胎牛血清），37 ℃，50 mL/L CO₂条件下培养，2.5 mL/L胰酶消化转代.

　　1.2　肿瘤模型　4 wk龄～6 wk龄BALB/c裸鼠(第四军医大学实验动物中心提供)，体重16 g～20 g，无菌隔离器内饲养. 于臀部皮下接种人前列腺癌细胞PC-3m悬液0.1 mL（1×10⁷细胞），至瘤体大约0.5 cm³时开始给药.

　　1.3　合成物对肿瘤细胞的体外毒性试验

　　1.3.1　MTT试验　将PC-3，PC-3m细胞分别加至96孔培养板，每孔1×10⁴ cell·mL^-1, 同时加入不同浓度的MTX，MTX-α-Phe，MTX-α-Phe+CP-A及MTX-α-Arg，每个浓度设3个平行孔, 于37℃ CO₂培养箱内孵育48h. 加噻唑蓝PBS溶液(5mg·mL^-1) 每孔20 μL，37℃反应4 h，弃培养液及未反应的噻唑蓝，再加入0.1mL二甲基亚砜，测A₄₀₅值, 取平均值，计算其杀伤率.

　　1.3.2　集落形成试验　用软琼脂培养法^［6］,分为6组: ①MTX+肿瘤细胞；②MTX-α-Phe+肿瘤细胞；③MTX-α-Phe+CP-A+肿瘤细胞；④MTX-α-Arg+肿瘤细胞；⑤MTX-α-Arg+CP-A+肿瘤细胞；⑥对照组(肿瘤细胞). 其中各种试验药物(MTX，MTX-α-Phe、MTX-α-Arg)分为3个浓度(0.4，4，40 μg·mL^-1)，CP-A10μL (2.5mU·μL^-1)，肿瘤细胞200个·孔^-1. 37℃，50mL/L CO₂培养2wk，用乙酸、乙醇混合液(1∶3)固定2 h，显微镜下计算克隆形成率.

　　1.4　合成物对肿瘤细胞生长周期动力学影响　将细胞(PC-3，PC-3m)分别加入10 mL培养瓶中(细胞数10^6.mL^-1)，同时加入不同浓度的MTX，MTX-α-Phe，MTX-α-Phe+CP-A，于加药后6，16，24 h分别收集，用冷生理盐水洗2次，用950 mL/L冷乙醇固定. 按常规方法对细胞进行DNA染色(DNA染液由Coulter公司提供试剂盒), 应用流式细胞仪(FASS，Profile Ⅱ型，激光功率15 mW，绿光带道滤片488 nm）进行分析.

　　1.5　动物模型体内试验

　　1.5.1　分组与治疗　40只荷瘤裸鼠按瘤体大小随机分组:①对照组，给予生理盐水0.5 mL，iv；②治疗组Ⅰ，MTX 1 mg·kg^-1，iv；③治疗组Ⅱ，MTX-α-Phe 1.32mg·kg^-1，iv；④治疗组Ⅲ，精浆蛋白单抗一羧肽酶A偶联物(γ-SmMcAb-CP-A) 0.5mL (200mU·mg^-1)，iv；⑤治疗组Ⅳ，先偶联物0.5mL, iv，48 h后再MTX-α-Phe 1.32 mg·kg^-1(即ADEPT疗法), iv.

　　1.5.2　观察指标　①抑瘤率：给药后每周测定瘤体长径与短径，计算瘤体积(V=1/2×长径×短径²)的生长情况，计算肿瘤生长抑制率(抑瘤率).

　　②裸鼠生存时间：指从接受治疗到自然死亡的时间. ③放免显像：用¹²⁵I标记偶联物，iv后第12，24，48, 72 h行ECT显像，观察抗体的定位情况. ④病理组织学观察：包括大体标本检查及镜检，取肿瘤组织及重要脏器的组织，100 mL/L福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察.

　　2　结果

　　2.1　细胞毒性试验

　　2.1.1　MTT试验　从不同浓度的MTX，MTX-α-Phe，MTX-α-Phe+CP-A和MTX-α-Arg对肿瘤细胞杀伤曲线可以看出(Fig 1)，前体药物MTX-α-Phe与MTX-α-Phe+CP-A，两者活性差异约1 000倍，后者与MTX活性相当. 水解后游离MTX对肿瘤细胞的IC₅₀为3.8×10^-6 mol^.L^-1，而前体药物的毒性明显减弱，IC₅₀为7.2×10^-2 mol^.L^-1.

图1　前体药物对前列腺癌细胞杀伤曲线

　　fig 1　Cytotoxicant curve of prodrug to prostate cancer cell

　　2.1.2　集落形成试验结果　MTX-α-Phe和MTX-α-Arg均无杀伤前列腺癌细胞的作用，集落形成率分别为88%和91% (P＞0.05)；MTX，MTX-α-Phe+CP-A则有很强的杀伤作用，两者均无集落形成（P＜0.01).

　　2.2　细胞周期分析　从Fig 2看，经MTX-α-Phe+CP-A处理的细胞，其G₁/G₀期、G₂+M期细胞比率(%)明显增高(t=15.96和2.96，P＜0.01和P＜0.05)，而S期则显著下降(t=18.41，P＜0.01)，细胞增殖指数明显降低，并出现凋亡细胞，与MTX处理的细胞相似（P＞0.05）. 而经MTX-α-Phe处理的细胞动力学无明显变化.

　　2.3　对荷瘤裸鼠模型肿瘤生长的抑制作用

　　2.3.1　肿瘤体积的动态观察　第1周内，各组肿瘤体积无明显差异. 从第2周起，治疗组Ⅰ，Ⅳ肿瘤生长开始减慢，生长受到抑制. 第4周时，治疗组Ⅰ，Ⅳ的肿瘤体积明显小于其它组，其中Ⅳ组(ADEPT组)有7只肿瘤明显缩小，1只基本消失. 肿瘤抑制率明显高于其它组(P＜0.01). 治疗组Ⅱ，Ⅲ与对照组相比虽有缩小，但无差异(P＞0.05)，对照组肿瘤生长很快，部份肿瘤到后期发生溃破(Fig 3，4).

图2　各组前列腺癌细胞细胞周期分析

　　fig 2　Cell cycle analysis of prostate cancer cell in each group

　　^aP＜0.05，^bP＜0.01.

图3　肿瘤生长曲线

　　fig 3　Growth curves of tumor cell

　　2.3.2　裸鼠生存时间　各组荷瘤裸鼠生存期，对照组肿瘤生长快，其中3只发生腹腔脏器广泛转移，严重腹水，恶异质严重，平均生存期为28 d. 治疗组Ⅱ, Ⅲ与对照组无明显变化(P＜0.05)，平均生存期分别为31 d和36 d. 单用MTX(治疗组Ⅰ)虽然肿瘤生长受到抑制, 但荷瘤裸鼠生活质量较差，全血细胞数明显低于ADEPT组(P＜0.01)，生存期为72 d. 而ADEPT组的生存期最长，平均为89 d.

　　2.3.3　放射免疫显像　注射¹²⁵Ⅰ标记物后第12，24，48，72 h见肿瘤部位有明显核素聚集(Fig 5),以48 h最佳, T/NT值12.65. 说明抗体可以很好的携带偶联物定位于肿瘤部位.

图4　裸鼠肿瘤生长对照图

　　fig 4　Growth state of tumor in nude mouse

　　A：Compare groups；B：Therapy groups of ADEPT.

图5　¹²⁵I-偶联物放射免疫显像图

　　Fig 5　The radioimmunoimaging of ¹²⁵I-SmMoAb-CP-A

　　2.3.4　组织病理学检查　经过5 wk治疗后，治疗组Ⅰ, Ⅳ大体标本检查见肿瘤大面积坏死，切面呈黄白色，组织松脆，仅在周边部残留包膜及少量瘤组织，镜下见坏死瘤组织内散在片状钙化，癌细胞仅残留轮廓. 而对照组及治疗组Ⅱ, Ⅲ呈腺癌典型表现, 癌细胞生长活跃，有转移的裸鼠腹腔脏器发生广泛癌组织浸润.

　　3　讨论

　　目前制约肿瘤抗体导向治疗疗效的主要因素之一是到达肿瘤部位的药量不足，其原因有：①导向药物大分子对肿瘤的穿透力差，不能达到有效治疗量；②肿瘤组织和肿瘤细胞中抗原的异质性导致了导向药物分布的非均一性；③导向药物本身的稳定性及均一性也影响导向药物的抗肿瘤作用效果. ADEPT疗法就是针对这些问题而提出的，前体药物是一种本身没有生物活性，对正常组织细胞及骨髓无毒，但经特定降解酶水解后可转化为活性细胞毒分子. 利用抗体导向的原理，将前体药物的专一性活化酶选择性地投放于肿瘤组织部位，这样前体药物可以区域特异性地在肿瘤组织转化成大量的高活性细胞毒分子, 而且这种小分子细胞毒物质能够穿透肿瘤微血管，通过细胞膜较好地分布于肿瘤组织，从而发挥抗肿瘤作用^［7］. 本实验中的ADEPT治疗组，对荷瘤裸鼠前列腺癌肿瘤有明显抑制.

　　甲氨喋呤(Methotrexate,MTX) 是一种抗代谢类肿瘤化疗药物, 应用相当广泛，但MTX不仅能杀死肿瘤细胞，而且同时也抑制正常细胞，造成较严重的毒性反应，限制了临床高浓度、大剂量使用，影响治疗效果. 如果在MTX羧端谷氨酸的α-羧基上连接任何一个α-氨基酸，即成为MTX-α-肽. 这种化合物对所有的细胞均没有毒性，当它遇到合适的羧肽酶将羧端肽键水解后，就能释放出具有细胞毒性的MTX，这就为导向酶-前体药物疗法(ADEPT)提供了有利的条件. 我们合成的MTX-α-Phe用羧肽酶A可完全水解成MTX，两者活性差异约1 000倍，活性MTX在体外能很好的抑制前列腺癌的生长，在体内经精浆蛋白抗体导向酶体系作用，明显地抑制了荷瘤裸鼠前列腺癌的生长，动物的生活质量也明显优于单用MTX组. 而MTX-α-Arg则需羧肽酶N才能将其完全水解成MTX，羧肽酶N在人体的血清中有较高的含量，不适于用做人体ADEPT疗法（另文报道）. 因此，MTX-α-Phe+CP-A 是一对很好的治疗前列腺癌的ADEPT对，这就为进一步研究及临床应用打下了基础.

　　基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目　No.39300158

　　作者简介：郝晓柯，男，1959-06-13生，河北省平山县人，汉族. 1983年第四军医大学医疗系毕业，副教授，副主任医师，硕士研究生导师. 发表论文30篇. 电话：(029)3510595-77170

　　作者单位：郝晓柯　张盈华　殷　缨　韩云龙　第四军医大学唐都医院中心实验室　陕西　西安　710038

　　施溥涛中国科学院上海生化研究所

　　参考文献

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　　3.甄永苏.抗肿瘤导向药物研究的现状与展望,药学学报,1994；29(1):1-8

　　4.周思群,王耐勤.抗体导向酶一前药疗法在肿瘤治疗研究中的应用.中国药学杂志,1994；29(8):451-453

　　5.施溥涛，郝晓柯，陈　颖 et al.氨甲喋呤-a-肽的固相合成.药学学报,1997；32(2):106-109

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　　7.Kuox RJ，Connors TA.Antibody-directed enzyme prodrug therapy：Potential in cancer.Clin Immunol Ther,1995；2(1):136-140