前列腺癌组织雄激素受体N端区基因突变的研究

肿瘤防治杂志 2000年第2期第17卷 基础与临床研究

作者：于小玲　卢建　王晓慧　陈光椿　赵子文

单位：于小玲　赵子文(山东省滨州医学院病理生理学教研室　滨州市　256603)；卢建　王晓慧　陈光椿(第二军医大学基础部病理生理学教研室　上海市　200433)

关键词：前列腺癌；雄激素受体；基因突变

　　【摘要】目的：研究雄激素受体(AR)基因突变与前列腺癌(PC)发生、发展的关系。方法：采用自行设计的3对引物，检测了25例PC石蜡切片组织，对其AR的N端转录激活区进行了银染聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)和异常SSCP片段的DNA测序。结果：发现一患者的A片段有SSCP异常，经测序证实A外显子存在一错义突变(C⁹⁶⁶→A，Ser296Arg)。结论：这是一新发现的突变，这一突变位于转录激活区内，推测可改变AR的转导活性，从而影响AR的功能。

　　中图分类号：R737.25；R730.231　　文献标识码：A

　　文章编号：1009-4571(2000)02-0143-03

The study of N-terminal dormain of mutation of androgen receptor gene in prostate cancer tissues

YU Xiao-ling,LU Jian,WANG Xiao-hui,et al.

　　(Department of Pathophysiology,The Binzhou Medical University,Binzhou 256603)

　　【Abstract】Objective：To study the relationship between the mutation of androgen receptor(AR) gene and the development of human prostate cancer(hPC).Methods：With the 3 pairs of primers designed by ourselves,we detected the transcriptive dormain of N-terminal of AR gene in 25 paraffin-embedded slides of hPC by polymerase chain reaction-single strand conformation polymerphism(PCR-SSCP).The abnormal shift band was further detected by direct DNA cycle sequencing.Results：One mobility difference was found by SSCP.From this shift band we identified one point mutation in 296 amino acid (C⁹⁶⁶→A，Ser296Arg).Conclusions：It's an unreported point mutation.This result might change the transcriptive activity of AR.Further studies are needed to evaluate the effects of this mutation on AR function.

　　【Key words】prostate cancer；gene mutation；androgen receptor

　　前列腺癌(PC)是雄激素依赖性肿瘤，近年研究认为雄激素受体(AR)基因突变与PC发生、发展及内分泌治疗抵抗有关^［1］。国外对PC的研究表明在AR基因的8个外显子中，除外显子C外，其他外显子均无突变报道^［2］，PC组织中AR的基因突变呈明显异质性，突变率各家报道不一，也未发现明显的突变热点。第二军医大学病理生理教研室首先建立了PCR-SSCP分析方法，对部分睾丸女性化患者和PC患者AR基因的B～H外显子进行过一定研究，并发现4个未报道的突变位点^［3］，在此基础上，本实验又建立了A外显子的检测方法。AR基因的第一个大外显子A编码N端的转录调节区，该外显子与PC的发生、发展密切相关^［4，5］。国内迄今尚未见有该外显子的研究报道。本实验采用自行设计的3对引物建立了AR基因A外显子编码转录激活区的检测方法，并对25例PC的石蜡切片组织的AR基因进行了突变检测。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象

　　25例PC(PC₁～PC₁₅)石蜡切片组织，全部经病理证实为PC，其中低分化腺癌6例，中分化腺癌7例，高分化腺癌12例。

　　1.2　引物

　　自行设计了A外显子的3对引物(A₁、A₂、A₃)，引物碱基序列及所扩片段见表1。总扩增长度为383～1081位碱基，碱基位置计算参照文献^［6］。

　　1.3　试剂

　　Tag DNA聚合酶8 U/μl为加拿大ACGT公司产品；r-³²P-ATP为北京亚辉生物医学工程公司产品；DNA cycle sequencing kits为Epicenter公司产品，超纯丙烯酰胺为Sigma公司进口分装、N，N-亚甲基双丙烯酰胺为瑞士Fluka公司、低熔点琼脂糖为Sigma公司产品。

表1　PCR扩增A外显子所用引物序列及产物长度

　　1.4　方法

　　1.4.1　A外显子的PCR扩增　镜下挑取1～2张石蜡切片上的肿瘤细胞，加入100 μl裂解液(50 mM Tris-HC L pH 8.0,1 mM EDTA pH 8.0，0.5% Tween 20) 55℃过夜，加入终浓度为400 μg/μl 蛋白酶K (PK) 55℃消化4～6天；煮沸灭活PK后，离心取上清1～3 μl进行PCR扩增，50 μl体系含模板约350 ng，4种dNTP各50 μmol，引物各0.25 μmol，1×PCR缓冲液，TagDNA多聚酶1^u。PCR反应在PCR仪(Perkin Elmer公司产品)上进行，先采用95℃热启动5 min，80℃加TagDNA酶，循环参数为：93℃、58℃、72℃各1 min，38个循环，最后一个循环完毕后于72℃继续延伸7 min。

　　1.4.2　琼脂糖凝胶电泳　用2%琼脂糖电泳检测所扩产物。取PCR产物5 μl与分子Marker同时点样于含0.5 μg/ml EB的2%琼脂糖凝胶上，4 V/cm电泳1～2 h，紫外灯下观测所扩片段并拍照。

　　1.4.3　SSCP分析　将所有PCR特异性产物行SSCP分析。取一定量PCR产物(约5～15 μl)于加样缓冲液(60%二甲基亚砜、0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯青)以2∶1比例混合，95℃变性5 min后置冰浴中冷却，根据所扩片段大小分别上样于6%～12%的非变性聚丙稀酰胺凝胶(胶连度99∶1，胶中含5%甘油)，以1×TBE为缓冲液，在20℃、25 mA电泳至指示剂溴酚蓝达到胶底部。凝胶采用硝酸银染色后观察结果。

　　1.4.4　从凝胶中回收泳动变位片断及PCR再次扩增　从聚丙烯酰胺凝胶中回收泳动变位片段，酚/氯仿抽提后PCR扩增，然后用低熔点琼脂糖凝胶回收和纯化目的片断。

　　1.4.5　泳动变位片断的双链DNA循环测序　用r-³²P-ATP标记一端引物，按测序试剂盒说明进行测序反应，用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(含7 M尿素)在55 W，50℃条件下电泳约3 h，电泳结束后-70℃行放射自显影，24～36 h洗片。2　结果

　　2.1　PCR扩增

　　PCR扩增AR基因A外显子的转录激活区片段，结果均扩增出单一的特异性条带，没有发现大片段的插入或缺失突变。图1显示了PC10患者A外显子的A₁～A₃片段的PCR扩增结果。

图1　PC10患者A外显子

　　(A₁～A₃)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

　　2.2　SSCP分析

　　对PCR特异性产物进行了SSCP分析。发现了患者PC10在外显子A的A₃片段有泳动变位，表明这个片段有SSCP分析异常。图2显示PC10患者的SSCP分析结果。

图2　PC10患者的SSCP分析结果

　　2.3　SSCP异常片段的序列分析

　　PC10患者AR基因的A外显子泳动变位片段(A₃)经测序结果证实有一点突变(C⁹⁶⁶→A，Ser296Arg)。图3为正常人和PC10患者AR基因A₃外显子序列分析结果。从图中可见，患者在第996位碱基上不仅有正常碱基C，还存在一突变碱基A，表明前列腺癌细胞中AR的基因突变具有异质性。

图3　正常人和PC10患者AR基因

　　A₃外显子序列分析结果

　　3　讨论

　　AR属甾体激素受体超家族的成员之一，为一类配体依赖性的转录调节因子，与雄激素结合后，能通过与靶基因中的雄激素反应元件结合，调节靶基因的表达，产生生物学效应。在PC组织中AR介导雄激素促进癌细胞增殖的确切机制尚不很清楚。AR基因有8个外显子，其中A外显子最大，长度大于1.6 kb，编码约由550个氨基酸残基组成的N端区即转录激活区，研究表明，其中第141～338位氨基酸对于AR的转录活性是必需的^［7］，其突变将导致受体功能的丧失。此外，N端区还含有编码不同寡聚或多聚氨基酸的三核苷酸重复顺序，如微卫星顺序CAG、GGC等，其中CAG重复数或长度与AR的转录活性呈负相关，与PC发生有密切关系^［4］。国外通常用7～9对引物PCR扩增A外显子，在此基础上进行突变分析。迄今国外已报道了发生在外显子A的9种突变，除一例单碱基缺失外，其余的均为错义突变^［2］。而国内尚无AR的A外显子的突变研究报道。本实验首先用三对引物扩增A外显子的108～383 bp片段，该片段主要编码N端的转录激活区。扩增的PCR产物经SSCP筛选发现了一泳动变位条带，测序结果证实存在一错义突变(C⁹⁶⁶→A，Ser296Arg)，突变恰好位于转录激活区内，推测这一突变能影响AR转录活性，从而导致AR功能丧失。这一突变未见报道，是一新发现的突变位点。具有这一突变的PC10患者为分化程度差的透明细胞癌，患者曾用过抗雄激素治疗，但效果不好。提示患者的PC是雄激素抗性的。患者的雄激素抗性是否与此突变有关，是一很有意义的问题，我们将进一步对突变受体行功能分析，以寻找AR突变与PC发生、发展及内分泌治疗的关系。

　　PC组织中的AR基因突变具有异质性，这是由于肿瘤组织可自发地不断出现AR表型不同的细胞亚群，表现为有的PC细胞的AR表型与正常细胞相同，而有的PC细胞却可能有AR的基因突变和基因扩增^［8］。Jaya P等曾报道6例PC组织的AR基因突变，其中4例证实有异质性^［9］。本实验在对PC10患者的A₅片段测序时同时出现正常和异常条带，也表明存在异质性。

　　本课题受国家自然科学基金(39670300)资助

　　参考文献：

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　　［3］Edward GIOVANNUCCI,Meir J.STAMPFER,Krishna KRITHIVAS,et al.The CAG Pepeat with the Androgen Receptor Gene and its Relationship to Prostate Cancer［J］.Pro Nat1 Acad Sic USA,1997,94:3320-3323.

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　　［5］Chen Guang.chun(陈光椿)，Lu Jian(卢建),Xu Xiao-chun(徐晓春),et al.Mutations in the Androgen Receptor Gene of Seven Chinese Patients with Complete Androgen Insensitivity Syndromes［J］.J Med Coll PLA,1997,12(4):338-342.

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　　［9］Jaya P.Gaddipati,David G.Meleod.Howard B.Heidenberg,et al.Frequent Detection of Codon 877 Mutation in the Androgen Receptor Gene in Advanced Prostate Cancer［J］.Cancer Research,1994,54:2861-2864.

收稿日期：1999-08-23

修回日期：1999-09-21