IFN-γ基因转染膀胱癌瘤苗诱导的特异性抗肿瘤免疫反应

中华泌尿外科杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：辛军　王晓雄　孟书礼　王鑫　刘爽　刘玉晶

单位：100853 北京，解放军总医院泌尿外科(辛军、王晓雄、孟书礼、刘玉晶)；军事医学科学院基础所(王鑫、刘爽)

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；细胞株；免疫性

　　摘要　探讨转IFN-γ基因膀胱癌瘤苗的可行性。采用脂质体介导法将携带鼠IFN-γ基因的逆转录病毒载体转染入鼠膀胱癌细胞系BTT 739中，免疫荧光法检测转基因细胞MHC I类抗原表达；动物实验观察其致瘤性和抗肿瘤免疫功能。结果显示：建立能自分泌IFN-γ的膀胱癌瘤苗BTT 739/IFN-γ，瘤苗细胞MHC I类抗原表达量明显增加，致癌性显著降低，并可诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫， T淋巴细胞在抗肿瘤免疫过程中起重要作用。结果证明：转IFN-γ基因膀胱癌瘤苗可诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫反应。

　　Induction of specific anti-tumor immunity by interferon-γ genetransferred bladder cancer vaccine　Xin Jun,Wang Xiaoxiong,Men Shuli,et al.Department of Urology,General Hospital of PLA,Beijing 100853

　　Abstract　To study the feasibility of interferon-γ gene-transferred bladder cancer vaccine,retroviral vector carrying murine interferon-γ (IFN-γ) cDNA genes were transfected into the murine bladder cancer line BTT 739 by lipofectamine method.Expression of MHC class I antigens were detected in BTT 739 sublines through fluorometry and the tumoriginicity and the anti-tumor immunity were studied in the experimental models.The results demonstrated that the bladder cancer vaccine (BTT 739/IFN-γ) autosecreting IFN-γ has been established and the expression of MHC class I antigens has been increased in the BTT 739/IFN-γ cell.It has been demonstrated that IFN-γ gene-transfected tumor vaccine decreased apparently the tumoriginicity and could induce the specific antitumor immunity which seems to be mediated by effector T cells.It was concluded that the IFN-γ gene-transferred bladder cancer vaccine could induce the in vivo specific antitumor immunity.

　　Key words　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Cell line　　Immunity

　　IFN-γ是一种有显著抗肿瘤作用的细胞因子，它在诱导细胞毒T淋巴细胞抗肿瘤的免疫调节中起重要作用并能提高主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原的表达，该抗原的表达对特异性免疫识别和排斥肿瘤具有决定性作用，此外IFN-γ还能增强NK细胞的杀伤活性并激活巨噬细胞^［1，2］。我们将IFN-γ基因导入小鼠膀胱癌细胞，通过IFN-γ基因的表达及增强肿瘤细胞的免疫原性，使肿瘤细胞在体内的致瘤性降低并引起机体产生特异性抗肿瘤免疫反应，为建立膀胱癌IFN-γ基因治疗提供实验依据。

　　材料和方法

　　一、实验材料

　　携带小鼠IFN-γ cDNA的重组逆转录病毒载体pZip-IFN-γ，由日本京都大学Watanabe教授惠赠，小鼠膀胱移行细胞癌细胞BTT 739(源于同基因小鼠T 739)由南京铁道医学院泌尿科提供。小鼠纤维肉瘤细胞系C3 H8.2由军事医学科学院分子生物学室提供。脂质体、CD₈单抗、G418购自CIBCO及华美公司。8周龄近交系 T739小鼠由中国医学科学院肿瘤研究所动物室提供。

　　二、IFN-γ高分泌细胞克隆的筛选

　　采用脂质体介导法将pZip-IFN-γ转染BTT 739细胞。G418选择培养基筛选出各个G418抗性细胞克隆，收集上述克隆的培养上清，用WISH细胞病变抑制法检测上述上清中IFN-γ活性^［3］，以IFN-γ活性最高者为IFN-γ高分泌细胞克隆株(BTT 739/IFN-γ)。

　　三、流式细胞仪行细胞DNA周期分析

　　收集膀胱癌细胞，RNA酶消化，酒精固定、溴化乙啶染色后上机分析。

　　四、细胞MHC I类抗原表达水平检测

　　采用免疫荧光和细胞上ABC-ELISA方法。I抗为鼠抗MHC I类单克隆抗体M₁/42，FITC标记兔抗鼠IgG，抗鼠IgG ABC试剂盒为Dako公司产品。操作按试剂盒说明书进行。

　　五、皮下接种后肿瘤生长能力的观察

　　T 739小鼠股部皮下注射1.5×10⁵个BTT 739各亚型细胞，实验分3组：野生型BTT 739细胞组、转染空白载体的BTT 739细胞(BTT 739/Neo)组、BTT 739/IFN-γ细胞组。观察4周，注射部位出现直径2mm以上的肿瘤结节为阳性，观察10周，若不出现肿瘤结节者为阴性。

　　六、脾细胞中和肿瘤试验

　　1.5×10⁵ BTT739/IFN-γ细胞皮下免疫T 739小鼠，3周后处死小鼠，取脾脏制成免疫脾细胞悬液。从正常T 739小鼠获取正常脾细胞。将正常脾细胞、免疫脾细胞、免疫脾细胞加CD₈单抗，这3组效应细胞分别与1.5×10⁵靶细胞BTT 739按2.5∶1、10∶1、40∶1的效靶比例混合，然后皮下接种T 739小鼠，观察成瘤情况。

　　结　　果

　　一、高分泌IFN-γ膀胱癌细胞株的建立

　　用脂质体介导法将pZip-IFN-γ导入BTT 739细胞，经G418筛选阳性克隆细胞，检测各个克隆培养上清中IFN-γ活性，其中，IFN-γ最高分泌克隆(BTT 739/IFN-γ)每24小时每5×10⁴细胞分泌IFN-γ达28 IU/ml。而转入空白载体pZip-Neo(作为实验对照)的细胞BTT 739/Neo及野生型BTT 739细胞均无IFN-γ分泌活性。

　　二、流式细胞分析细胞DNA周期

　　BTT 739/IFN-γ、BTT 739/Neo和BTT 739细胞三者之间G₀/G₁期、S期及G₂/M期的DNA含量无明显差别。在体外培养过程中亦未见到细胞形态和生长特性的变化。表明IFN-γ基因的导入及表达对BTT 739细胞生长增殖无直接影响。

　　三、细胞表面MHC I类抗原的表达(附图)

　　从附图中可以看出，BTT 739/Neo与BTT 739细胞相比，其MHC I类抗原表达量无明显差别，而BTT 739/IFN-γ细胞表面MHC I类抗原表达量约为BTT 739的3倍，表明IFN-γ基因的导入，确能提高膀胱癌细胞MHC I类抗原的表达水平。

附图　细胞表面MHC I类抗原的表达水平

　　四、BTT 739各亚型细胞的致瘤性

　　8只皮下接种1.5×10⁵个野生型BTT 739细胞的小鼠和8只皮下接种BTT 739/Neo细胞的小鼠，全部出现肿瘤，而接种相同数量BTT 739/IFN-γ细胞的30只小鼠仅有2只形成肿瘤，且肿瘤生长较野生型肿瘤缓慢。表明BTT739/IFN-γ细胞体内生长能力明显下降，即致瘤性显著降低。

　　将排斥BTT 739/IFN-γ细胞(即未形成肿瘤)的小鼠随机分成2组，每组8只，皮下再次接种1.5×10⁵野生型BTT 739细胞或小鼠纤维肉瘤C3H8.2细胞，接种BTT 739的小鼠均未形成肿瘤，而接种C3H8.2的小鼠与未经免疫组(未先接种BTT 739/IFN-γ细胞)的小鼠均形成肿瘤。该结果提示：先用BTT 739/IFN-γ细胞(基因瘤苗)免疫小鼠，可增强机体的特异性抗肿瘤免疫功能，诱导免疫保护，防御再次接种的野生型BTT 739细胞形成肿瘤。

附表　不同效靶细胞比小鼠肿瘤形成率

　　脾细胞中和肿瘤试验显示，以正常脾细胞为效应细胞，不同效靶比例混悬液皮下接种的小鼠，其肿瘤形成率波动于80%～100%，而以免疫脾细胞为效应细胞，小鼠肿瘤形成率波动于20%～50%(附表)，表明用基因瘤苗(BTT 739/IFN-γ细胞)免疫小鼠可诱导产生具有较高抗肿瘤活性的效应细胞，并明显抑制同基因型小鼠肿瘤的形成。免疫脾细胞用CD₈单抗处理后，该组小鼠成瘤率为80%～100%。上述结果提示，在排斥BTT 739膀胱癌细胞过程中，效应细胞可能起决定作用。讨　　论

　　通过接种瘤苗进行肿瘤治疗的研究已有相当长的历史，尽管采用了多种瘤苗，但效果并不显著，主要原因是以往制备的瘤苗不能有效地激发机体产生显著的特异性抗肿瘤免疫功能。近年来人们运用基因修饰后免疫原性增强的新型瘤苗治疗肿瘤，其中以细胞因子基因转染的瘤苗的研究最为热门^［4］。

　　目前人们已将多种细胞因子如IL-2、IL-4、GM-CSF、TNF、IFN-γ等的基因转移至多种肿瘤如黑色素瘤、乳腺癌、肾癌等细胞并观察了这些基因转染的肿瘤细胞在体内外的生长特性。用其中一些细胞制备的瘤苗在预防肿瘤的发生及治疗肿瘤的研究中也取得一定的进展^［5～9］。1989年Watanabe等^［8］首先把IFN-γ基因转入神经母细胞瘤细胞，发现转基因的瘤细胞接种于同基因小鼠，使细胞毒T淋巴细胞(CTL)介导的MHC限制性免疫反应增强，CTL活性和机体抗肿瘤作用增强，瘤细胞MHC I类抗原表达增强，自此揭开了基因瘤苗研究的序幕。Porgador等^［9］将IFN-γ基因转染鼠肺癌细胞，治疗微小转移癌，发现高分泌IFN-γ的基因瘤苗可治愈转移瘤。这使人们意识到将IFN-γ基因转移至肿瘤细胞的研究对于探讨IFN-γ基因瘤苗的抗肿瘤作用机理及研究IFN-γ基因治疗具有重要的价值。

　　我们将携带IFN-γ基因的逆转录病毒载体转染膀胱癌细胞BTT 739，经筛选获得分泌IFN-γ的细胞株，观察到IFN-γ基因转染的BTT 739/IFN-γ细胞在形态、DNA周期分析和在体外的生长状况，与野生型BTT 739细胞均无明显差异，这说明转基因细胞自分泌的低剂量IFN-γ对细胞的生长没有直接的抑制或促进增殖作用。将BTT 739/IFN-γ细胞接种小鼠，发现其致瘤性显著下降。致瘤性降低的可能原因：(1)转IFN-γ基因的肿瘤细胞其表面的MHC I类抗原表达增强，导致肿瘤抗原提呈作用提高，从而增强了肿瘤细胞的免疫原性，有效地刺激机体识别这些抗原，继而产生较持久的抗肿瘤免疫。(2)肿瘤部位以自分泌形式持续、低量地分泌IFN-γ，有效地动员各类效应细胞在肿瘤局部聚集，增强这些细胞的抗肿瘤活性。排斥BTT 739/IFN-γ细胞的小鼠，6周后再接种致瘤量野生型BTT 739并不形成肿瘤，机体可能是通过相关识别机制将瘤细胞杀灭。若接种和BTT 739无交叉免疫反应的纤维肉瘤C₃H8.2细胞则实验鼠均形成肿瘤，表明IFN-γ基因转染的膀胱癌瘤苗所诱导的抗肿瘤免疫是具有肿瘤特异性的。脾细胞中和肿瘤试验结果表明，IFN-γ基因瘤苗免疫后的小鼠脾细胞对抑制野生型肿瘤的形成具有强大的防御作用。而CD₈单抗基本能消除免疫脾细胞的抑瘤作用，这说明 T淋巴细胞在介导特异性抗肿瘤免疫过程中起重要作用。

　　总之，本研究表明BTT 739/IFN-γ细胞能诱导机体的特异性抗肿瘤免疫，为进一步开展转IFN-γ基因膀胱癌瘤苗的应用研究奠定了基础。

　　本课题受“九五”全军医药卫生科研基金项目资助

　　参　考　文　献

　　1　Dorudi S,Northover JMA,Vile RG.Gene transfer therapy in cancer.Br J Surg,1993,80∶566-572.

　　2　Hiura M,Hashimura T,Watanabe Y,et al.Induction of specific anti-tumour immunity by interferon-γ gene-transferred murine bladder carcinoma MBT-2.Folia Biologica,1994,40∶49-61.

　　3　辛军，王晓雄，王鑫，等.逆转录病毒载体介导的人IFN-γ基因在膀胱细胞中的表达.中华医学杂志，1997，77∶778-779.

　　4　曹雪涛，于益芝，徐志工，等.IL-4基因转染瘤苗体内抗肿瘤转移作用及其免疫机理的初步研究.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15∶53-57.

　　5　Saito S,Bannerji R,Gansbacher B,et al.Immunotherapy of bladder cancer with cytokin gene-modified tumor vaccine.Cancer Res,1994,54∶3516-3520.

　　6　Hilliard FS,Timothy LD,Zeinab AW,et al.Clinical protocol:A phase I trial of human IFN-γ transduced autologous tumor cells in patients with disseminated malignant melanoma.Human Gene Therapy,1995,5∶761-777.

　　7　Mclani C,Chiodoni C,Aricnti F,et al.Cytokine gene transduction in tumor cells:IL-2 or IL-4 gene transfer in human melanoma cells.Nat Immun,1994,13∶76-86.

　　8　Watanbe Y,Kuribayashi K,Miyatake S,et al.Exogenous expression of mouse interferon-γ cDNA in mouse neuroblastoma C1300 cells results in reduced tumorigenicity by augmented anti-tumor immunity.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86∶9456-9460.

　　9　Porgador A,Bannerji R,Watanabe Y,et al.Antimetastatic vaccination of tumor-bearing mice two types of IFN-γ gene-inserted tumor cells.J Immunol,1993,150∶1458-1470.

(收稿：1997-07-30)