以体外侵袭力构建高转移膀胱癌细胞亚系

中华泌尿外科杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：宋波　金锡御　潘进洪　方强　杨航

单位：400038 重庆，第三军医大学附属西南医院泌尿外科

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；细胞株

　　摘要　以穿透人工基底膜能力为依据筛选具有体外高侵袭能力的膀胱癌细胞，观察侵袭与转移的关系。用体外培养法收集扩增能侵袭穿透人工基底膜的细胞，对比筛选前后细胞体内外增殖和侵袭转移能力。结果显示：筛选后的子代细胞体外侵袭力均有明显的提高，其中有2株子代细胞裸鼠皮下接种后能形成肿瘤局部侵袭和淋巴结转移。表明侵袭对转移形成有重要影响，但完成转移还需要其它因素的参与。转移能力与细胞增殖有一定关系，但却分别受不同因素控制。

　　Establishing high metastatic bladder cancer sub-cell lines according to their in vitro in vasion ability　Song Bo,Jin Xiyu,Pan Jinhong,et al.Department of Urology,Southwestern Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038

　　Abstract　Using a specially constructed in vitro invasion chamber cells that penetrate the Matrigel were selected and cultured to establish offspring cell lines.The difference between offspring and parent cell lines in proliferation and metastasis were investigated.The results revealed (1)In vitro invasion ability of all offspring cell lines were enhanced significantly,Es3 and Ts3 cells had acquired ability of lymph node metastasis in nude mice but Bs3 could not form metastasis.This suggested that invasion is a very important property for metastasis formation but some other properties are also required (2) The proliferation rate of Es3 and Ts3 in nude mice was not different significantly comparing to their parental cells.This suggested that metastasis and tumor cell proliferation were controlled by different mechanisms.

　　Key words　Bladder neoplasms　　Carcinomas　　Cell line

　　Poste等^［1］提出肿瘤转移异质性理论，认为在肿瘤组织中存在着具有不同侵袭转移能力的细胞亚群，而只有那些具有能完成侵袭转移全过程能力的瘤细胞才能最终形成转移灶。因此可依据某些侵袭转移有关因素的表达与否筛选出具有不同侵袭转移能力的瘤细胞。侵袭是转移发生最重要的一步。以膀胱移行细胞癌(TCCB)为例，癌细胞必须穿透膀胱基底膜才能侵入肌层，必须穿透血(淋巴)管基底膜才能进入和离开血(淋巴)循环，必须穿透转移器官的细胞外基质才能在转移器官中定植并生长。本研究以穿透人工基底膜能力为依据筛选具有体外侵袭力和体内转移能力的细胞亚系。

　　材料与方法

　　一、主要材料

　　BIU-87细胞，由北京医科大学泌尿外科研究所俞莉章教授惠赠；EJ细胞及T₂₄细胞，均来源于人侵袭性膀胱癌，重庆医科大学病理教研室提供。NIH3T3细胞，来源于鼠胚胎纤维母细胞。Millicell chamber，为一杯状结构，杯底为一多碳素膜封闭，膜孔直径12μm,购自Sigma公司；Matrigel，大鼠ESH肉瘤细胞外基质提取物，富含Ⅳ型胶原，与天然基底膜成分十分相似^［2］，北京医科大学病理教研室提供。

　　二、实验方法

　　1.细胞培养：细胞培养按常规操作进行。各种待研究肿瘤细胞消化后用无血清细胞培养液洗涤3次，制成适当密度的细胞悬液备用。制备NIH3T3细胞条件培养基备用。

　　2.侵袭小室构建：参照文献^［3］加以改良。Matrigel用无血清细胞培养液稀释后按每个Millicell chamber 100μg，均匀加于多碳素膜上，紫外线照射过夜，使用前浸于无血清细胞培养液中，置37℃，30分钟，使Matrigel水化并成胶冻状，制成侵袭膜。取NIH3T3细胞条件培养基，按0.6ml/孔加入24孔细胞培养板中，将侵袭膜放入24孔板中，取待研究细胞悬液，按0.2ml/孔(约含10⁵个细胞)加于膜上。置CO₂培养箱。

　　3.细胞筛选：待筛选细胞加入侵袭小室，经7小时培养后取出侵袭膜。留下贴附于24孔板内的细胞，用含10%小牛血清的细胞培养液常规培养至传代。将筛选后的细胞再重复进行筛选，共3次，后一次筛选均较前一次Matrigel用量增加50μg/膜。EJ、T₂₄及BIU-87细胞完成三次筛选后的子代细胞分别命名为E_s3，T_s3及B_s3。

　　4.体外侵袭力测定：子代细胞分别加入侵袭小室内，培养12小时，用棉签擦去侵袭膜上面的瘤细胞和Matrigel，龙胆紫染色后计数位于侵袭膜背面和贴附于24孔板内的细胞数量，每株细胞用3个侵袭小室，计算平均值。

　　5.裸鼠体内转移研究：母代和子代细胞分别于裸鼠双侧前肢外侧皮下接种，每个位点接种1×10⁷个细胞，每株细胞接种5只裸鼠。30天后断颈处死，取肿瘤、肺、肝、肾及淋巴结作连续病理切片检查。取腋下淋巴结作体外培养，观察能否培养出肿瘤细胞。

　　6.体外生长曲线测定：母、子代细胞按10⁴/孔分别加入24孔细胞培养板中，每株细胞9孔，分别于2、4、6天每株细胞取3孔，消化计数，计算平均值，绘制生长曲线。

　　结　　果

　　一、体内、外生长情况

　　T₂₄、T_s3、EJ及E_s3均在裸鼠接种后第3天形成瘤节结，成瘤率为100%，肿瘤生长速度和体积无明显差异。BIU-87和B_s3分别于接种后2周和1周始见肿瘤结节，成瘤率分别为50%和75%，且肿瘤生长较缓慢。

　　子代细胞体外增殖速度均不同程度的高于其相应的母代细胞，其中T_s3和B_s3细胞体外增殖速度提高较明显(图1)。

　　二、体外侵袭力

　　子代细胞侵袭穿透Matrigel后贴附于侵袭膜背面和24孔板内的细胞数量均明显多于其相应的母代细胞(图2)。E_s3、T_s3及B_s3较其相应的母代细胞体外侵袭力分别增加6.4、4.3和1.9倍。

　　三、裸鼠体内转移

　　EJ、T₂₄及BIU-87细胞均不形成转移灶，肿瘤表面光滑与皮肤及皮下组织界限清楚。E_s3及T_s3肿瘤分别有62%和50%呈局部侵袭性生长，且经病理和淋巴结培养证实100%均形成腋下淋巴结转移。B_s3肿瘤既无局部侵犯又无淋巴结转移。为排除因肿瘤生长缓慢而未形成转移之可能，BIU-87和B_s3肿瘤鼠各留出1只，延迟到70天和60天处死，仍无侵袭和转移形成。所有细胞均无其它脏器转移。

　　子代细胞与其相应的母代细胞形态特征无明显差别，经15次以上传代后其形态、增殖、体外侵袭和体内转移特征无明显变化。

图1　母/子代细胞体外侵袭个数对照

图2　母/子代细胞体内外增殖对照

　　讨　　论

　　一、细胞筛选模型及原理

　　1.以NIH3T3细胞条件培养基作为趋化因子，使肿瘤细胞向24孔板底方向移动。

　　2.以Matrigel模拟天然基底膜，在多碳素膜上形成一胶冻状物，封闭多碳素膜上的小孔，只有那些具有蛋白水解能力的瘤细胞才能穿过。

　　3.多碳素膜上的小孔直径稍小于肿瘤细胞，具有较强的变形和运动能力的细胞可以通过膜孔。

　　4.多数瘤细胞穿透侵袭膜后贴附于侵袭膜背面，计数侵袭膜背面的细胞数是常用的评价体外侵袭力的指标^［4］。本研究只收集和扩增穿透侵袭膜后掉到24孔板上的细胞，因此所筛选出的细胞可能具有较强的蛋白水解能力和移动能力，而粘附能力则可能较弱。

　　二、体外高侵袭与体内转移

　　侵袭是转移发生最初的一步，是转移性肿瘤必备的基本特性之一^［5］。粘附、蛋白水解及细胞游走能力是影响侵袭的三个主要因素^［6］。本研究所用的三株膀胱癌细胞经筛选后体外侵袭力均有明显提高，其中E_s3和T_s3均能形成肿瘤局部淋巴结转移，表明侵袭力对TCCB转移的产生有着十分重要的影响。

　　本实验中，B_s3虽然也有较强的体外侵袭能力，但却未能形成体内转移，其可能原因为：(1)BIU-87细胞来源于浅表性TCCB，而T₂₄和EJ均来源于侵袭性TCCB，提示BIU-87细胞缺乏除侵袭以外的其它转移所需特性。(2)B_s3体外穿透侵袭膜的细胞数显著高于E_s3和T_s3，但B_s3穿透侵袭膜后绝大多数贴附于膜背面而E_s3和T_s3则有较多的掉入24孔板内。表明它们在影响侵袭行为有关因素的表达上存在着差异，B_s3粘附能力可能较强，从而导致体外侵袭力与体内侵袭行为上的差异。B_s3与T_s3及E_s3体外侵袭力与体内转移行为的差异也充分证实转移灶的形成是一个多环节、多步骤的过程，侵袭仅是其中的一个重要环节^［7］。

　　三、肿瘤转移异质性

　　本研究结果显示：(1)肿瘤转移异质性不仅存在于肿瘤组织中，也存在于肿瘤细胞系中，究其原因尚无圆满解释，可能与遗传和变异有关。(2)肿瘤转移异质性还体现在转移所需的某些特性或完成转移所需某些环节上的差异。本实验中B_s3虽也具有较高的体外侵袭力但却不能产生体内侵袭和转移即可说明此点。(3)在本实验中EJ和T₂₄细胞经筛选后的子代细胞在30天的观察期内均形成局部淋巴结转移，表明转移能力的高低取决于具有侵袭转移能力的细胞亚群的数量，这种细胞数量越多，形成转移的机会越高，从肿瘤发生到形成转移所需的时间越短。这可能是有的肿瘤较早就发生转移，而有的则在较晚才发生转移的原因。(4)本研究所建立的子代细胞在体内、外增殖速度虽与其相应的母代细胞有所不同，但增殖速度与转移能否形成并无密切的关系：B_s3体外增殖速度明显升高，但不能形成转移；T_s3和E_s3体内增殖速度与其相应的母代细胞并无显著的差别却能形成局部侵袭和淋巴转移。提示转移和增殖分别受不同的因素控制，据此可认为肿瘤中还可能存在着增殖异质性等多种异质性。

　　TCCB转移是受多因素控制的过程，侵袭是其中的一个重要环节，研究与侵袭转移直接相关的因素，而不是只重视增殖、肿瘤大小、数目等非直接相关因素，才是认识并最终防治侵袭转移的正确途径。

　　参　考　文　献

　　1　Poste G,Fidler IJ.Pathogenesis of cancer metastasis.Nature,1980,283∶139-146.

　　2　Kleinman HK,McGarver ML,Hassell JR.Basement membrane complexes with biological activity.Biochemistry,1986,25∶312-318.

　　3　Nabeshima K,Komada N,Kishi JI,et al.TPA-enhanced invasion of Matrigel associated with augmentation of cell motility but not metalloproteinase activity in a highly metastatic variant (L-10) of human rectal adenocarinoma cell line RCM-1.Int J Cancer,1993,55∶947-981.

　　4　Sato H,Seiki M.Membrane-type matrix metalloproteinases (MT-MMPs) in tumor metastasis.J Biochem,1996,119∶209-215.

　　5　Chambers AF,Macdonald IC,Schmidt EE.Steps in tumor metastasis new concepts from intravital videomicroscopy.Cancer Metastasis Rev,1995,14∶279-301.

　　6　Ray JM,Stetler-Stevenson WG.The role of metrix metalloproteinases and their inhibitors in tumor invasion,metastasis and angiogenesis.Eur Respir J,1994,7∶2062-2072.

　　7　Saiki I,Murata J,Yoneda J, et al.Influence of fibroblasts on the invasion and migration of highly or weakly metastatic B₁₆ cells.Int J Cancer,1994,56∶867-873.

　　(收稿：1998-03-06)