α-干扰素对膀胱癌细胞多药耐药性逆转的研究

中华泌尿外科杂志 1999年第5期第20卷 论　著

作者：金欢胜　杨唐俊　何斌　王祥卫

单位：400037　重庆,第三军医大学第二附属医院泌尿外科

　　关键词： 膀胱肿瘤,癌,多药耐药性,α-干扰素

　　【摘要】　目的　研究α-干扰素(α-IFN)对膀胱癌多药耐药性的逆转作用。　方法　应用 mTT法检测阿霉素(ADM)的细胞杀伤作用。荧光法检测细胞内阿霉素浓度和斑点杂交法检测mdr1 mRNA相对含量。　结果　500 IU/ml αIFN能明显增强阿霉素对耐药细胞BIU-87/ADM的杀伤作用,但不能增强阿霉素对敏感细胞BIU-87的杀伤作用;α-IFN能增加阿霉素在BIU-87/ADM细胞内的积聚，但不改变mdr1 mRNA在细胞内表达量。　结论　α-IFN对膀胱癌细胞多药耐药性具有逆转作用，其机制与α-IFN增加细胞内抗癌药物浓度有关,与增加mdr1 mRNA表达量无关。

　　Reversal of multidrug resistance by α-IFN in bladder cancer cell lines　JIN huansheng,YANG Tangjun,HE Bin,et al.Department of Urology,Xinqiao Hospital,The Third Military medical university,Chongqing 400037

　　【Abstract】　Objective　To study the reversal of multidrug resistance by α-IFN in bladder cancer cell line.　Methods　The effect of recombinant human α-interferon(αIFN) on the cytotoxicity of adriamycin(ADM) in human bladder cancer cell line BIU 87 and its multidrug resistant counterpart BIU-87/ADM were studied by MTT assay. ADM accumulation and level of mdr1 mRNA in above cell lines were also detected by spectrofluometric and dot blot analysis respectively.　Results　α-IFN(500IU/ml)increases the cytotoxicity effect and the accumulation of ADM in bIU-87/ADM cell line,but had no effect on the cytotoxicity of ADM to BIU-87 cell line,the level of mdr1 mRNA being unchanged.　Conclusions　α-IFN has significant effects on the reversal of multidrug resistance of human bladder cancer cell line.

　　【Key words】　Bladder neoplasms,Multidrug resistance,Interferon-alpha

　　应用非抑制剂量α-干扰素(α-IFN)＋小剂量阿霉素(ADM)分别对人膀胱移行上皮癌细胞BIU-87、BIU-87/ADM的杀伤作用进行研究，以探讨α-IFN对膀胱癌细胞多药耐药性的逆转作用。

　　材料和方法

　　一、细胞系及细胞培养

　　人膀胱移行上皮癌细胞系 BIU-87引自北京医科大学泌尿外科研究所，BIU-87/ADM细胞系由本科建立^［1］。培养基为含15%小牛血清的RPMI1640。

　　二、药物

　　ADM为意大利产品，α-IFN为国产。按所需浓度稀释，-20℃冻存。

　　三、细胞生存率的测定

　　应用MTT法检测各样品吸光度，并计算各种药物浓度下的细胞生长抑制率。

　　四、细胞内ADM积聚量测定

　　应用荧光法检测各样品ADM荧光强度，根据标准曲线计算单位细胞内ADM积聚量（用μg/10⁵细胞表示）。

　　五、mdr1 cDNA探针的制备及斑点杂交

　　按蔡文琴等^［2］介绍方法进行。膜显色后，置膜于GSG10型双波长薄层扫描仪540nm波长处扫描；用C-RIB型数据记录仪记录扫描图谱，并计算各点对应波峰的面积；用标准mdr1 cDNA浓度的对应数值作标准曲线，并由此曲线计算出各测定点所含相对同源DNA的mRNA量。

　　六、统计学处理

　　配对的计量数据采用配对Student-T检验，两参数间的关系用直线相关分析，两个样本率的比较用U检验，显著性界限为P＜0.05。

　　结　果

　　一、不同浓度的αIFN对细胞生长的影响

　　二、非抑制剂量α-IFN和ADM的复合抗癌细胞作用

　　BIU-87/ADM细胞经500IU/ml α-IFN作用24小时后,再用2μg/ml aDM作用1小时,3天后用MTT法检测,细胞生存率为(88.7±4.7)%；单用2μg/ml aDM作用1小时,3天后检测,细胞生存率为(97.1±1.8)%。说明α-IFN能显著增强ADM对BIU-87/ADM细胞的杀伤作用。但应用相同方法检测α-IFN+ADM对BIU-87细胞的杀伤作用发现,α-IFN不能增强ADM对BIU-87细胞的杀伤作用。

　　三、α-IFN对细胞内ADM积聚量的影响

　　标准的ADM浓度(X)与相应的荧光值(Y)呈正相关,直线回归方程为Y=36.4401X,r=0.9996,P＜0.001。在4种不同浓度的ADM作用下,BIU-87/ADM细胞内ADM积聚量均显著低于BIU-87细胞(P＜0.05)；而先应用500IU/mlα-IFN作用BIU-87/ADM细胞24小时后，则能使BIU-87/ADM细胞内ADM积聚量增加，与单用ADM相比较差异有显著性(P＜0.05)。

　　四、α-IFN对mdr1 mRNA表达的影响

　　mdr1 cDNA探针分别与BIU-87/ADM细胞及经α-IFN作用24小时后的BIU-87/ADM细胞进行斑点杂交，经薄层扫描仪对mRNA的定量分析表明，两者mRNA含量分别为(513.6±9.6)pg/μg总RNA和(543.5±49.7)pg/μg总RNA，差异无显著性(P＞0.05)。

　　讨　论

　　MDR的发生主要和mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-gp)有关,即在ATP的作用下,P-gp能主动地将细胞内的化疗药物泵出细胞外,从而降低肿瘤细胞内化疗药物的浓度,导致化疗失败。目前证实,奎尼丁、异搏定、环孢素A和奎宁等药物对MDR具有逆转作用,但上述药物作为逆转剂用于人体时,因其毒性难以达到逆转MDR的有效血浆浓度,因此难以应用于临床。IFN临床应用已10年,主要用于治疗黑色素瘤、白血病、低度恶性非霍奇金淋巴瘤及肾癌等,未见明显毒副作用^［3］。近年来,有报告应用IFN膀胱灌注治疗膀胱癌,因毒性较低,即使剂量达1×10⁹IU也未见毒性反应^［4］。α-IFN和一些化疗药物联合应用具有复合抗癌作用,并能逆转结肠癌和卵巢癌细胞的MDR,但其机理尚有争议^［5］。Scala等^［6］报道α-IFN能逆转人结肠癌MDR细胞LoVo/DOX的耐药性,认为其机制是α-IFN作用使细胞内的ADM含量增加,从而增加了ADM对MDR细胞的杀伤作用,但并不影响P-gp的表达。Kang等^［7］报道,α-IFN不能直接逆转中国仓鼠卵巢癌MDR细胞ChR c5的ADM耐药性,但能增强Tamoxifen、异搏定对该细胞ADM耐药性的逆转作用,其作用机理是α-IFN能增加VPL竞争性抑制P-gp和抗癌药物结合,使P-gp的药物泵功能下降,从而增加了细胞内ADM含量。

　　本实验结果显示：500IU/ml的α-IFN不能增强ADM对敏感细胞BIU-87的杀伤作用,但能显著增强ADM对耐药细胞BIU-87/ADM的杀伤作用。α-IFN使BIU-87/ADM细胞内的ADM浓度明显升高,但并不影响mdr1 mRNA在细胞内的表达量。以上结果表明,α-IFN能逆转人膀胱移行上皮细胞癌的MDR。其机理可能与下列因素有关：(1)α-IFN能直接抑制P-gp的功能；(2)α-IFN可能使BIU-87/ADM细胞对ADM的通透性增加,从而使细胞内ADM浓度明显升高；(3)α-IFN可能使ADM和细胞内结合蛋白亲和力增加,减少了ADM被P-gp泵出细胞外。所有这些尚待进一步研究证实。

　　参考文献

　　1　杨唐俊,范立新,杨清浩.人膀胱癌BIU-87细胞系多重抗药性的形成.中华泌尿外科杂志,1996,17:527-530.

　　2　蔡文琴,王伯云.实验免疫细胞化学和核酸分子杂交技术.第1版.成都：四川科学技术出版社,1995,354-432.

　　3　Samue baron MD,Stephen K,Tyring MD.The interferons:mechanism of action and clinical applications.JAMA，1991,10∶1375-1383.

　　4　孙燕,王金万.生物学治疗.见：吴阶平主编,泌尿外科.第1版.济南：山东科学技术出版社.1996,1083-1088.

　　5　Namba M ,Yamamoto S ,tanaka H.In vitro and in vivo studies on potentiation of cytotoxic effects of anticancer drugs by IFN on human neoplastic cells. cancer(Phila),1984,54∶2262-2267.

　　6　Scala S,Pacelli R,Laffaioli RU.Reversal of adriamycin resistance by recombinant α-interferon in multidrug resistant human colon carcinoma lovo-Doxorubicin cells. Cancer Res, 1991,51∶4898-4902.

　　7　Kang Y,Perry RR.Effect of α-interferon on P-gp expression and function and on VPL modulation of doxorubicin resistance. Cancer Res,1994,54∶2952-2958.

(收稿：1998-08-26　修回：1999-01-14)