鸡新城疫病毒抗膀胱癌作用的体内、体外实验研究

中国新药杂志 1999年第5期第8卷 实验研究

作者：黄　健　李　鸣　李　爽　俞莉章　顾方六

单位：（北京医科大学药理学系，北京 100083）

关键词：鸡新城疫病毒；膀胱癌；体内、体外实验

　　摘要　目的：研究鸡新城疫病毒(NDV)对膀胱癌细胞在体内、体外的杀伤作用。方法：采用了细胞培养和计数、光镜、电镜观察的方法及小鼠膀胱肿瘤模型（BST739）进行研究。结果：体外实验中，NDV组、卡介苗组及丝裂霉素C组对膀胱癌细胞均有明显的杀伤作用；用透射电镜观察NDV作用后的膀胱癌细胞，发现胞浆中有病毒颗粒。体内实验证明，NDV、丝裂霉素C和卡介苗对膀胱癌细胞都有一定的杀伤作用；在瘤内和瘤对侧注射NDV对膀胱肿瘤生长都有一定的抑制作用，且瘤内注射的效果远好于瘤对侧注射组。瘤内注射NDV组与对照组相比有明显的淋巴细胞浸润。结论：NDV对膀胱癌细胞在体内和体外均有一定的杀伤作用。

STUDY OF IN VITRO AND IN VIVO EFFECTS OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS

　　ON HUMAN BLADDER CARCINOMA

Huang Jian,Li Ming,Li Shuang,et al.

(Department of Pharmacology,Beijing Medical University,Beijing 100083)

　　ABSTRACT　OBJECTIVE：To study the in vitro and in vivo killing effect of Newcastle Disease Virus(NDV) on bladder carcinoma cells.METHODS:Bladder carcinoma mice model(BST739) was adopted and cells culture,cells counting,light microscope and electron microscope technique were used.RESULTS:Result of in vitro trial showed that significant killing effect on bladder carcinoma were observed in all 3 groups of NDV,BCG，and MMC and virus particles were found in cytoplasm by electron microscope.Results of in vivo study showed that some tumor cell killing effect were observed in all 3 agents of NDV,BCG,and MMC and some inhibitory effect on bladder tumor were observed in NDV group when administered by intra-tumor and opposite tumor injection but obvious lymph cell invasion was observed in NDV group in comparison with control group.CONCLUSION:NDV has some in vitro and in vivo killing effects on bladder tumor cells.

　　KEY WORDS　Newcastle disease virus;Bladder carcinoma;In vitro and in vivo trial

　　鸡新城疫病毒(NDV)是近年来随着生物治疗的兴起而引起人们重视的一种病毒，国外屡有报道NDV对消化道肿瘤、恶性黑色素瘤等恶性肿瘤有一定的治疗作用，对人体不良反应较小，是一种有前途的抗肿瘤生物制剂^［1，2］ 。但是，应用该病毒治疗膀胱肿瘤的研究目前尚未见报道。我们通过体内、体外实验客观地评价NDV对膀胱癌细胞的杀伤作用，并与丝裂霉素C(MMC)和卡介苗(BCG)进行比较，同时对NDV的抗癌作用机制进行了初步的探讨。

　　材料与方法

　　1　细胞和动物模型

　　人膀胱癌EJ细胞株由北京医科大学泌尿外科研究所提供。小鼠膀胱肿瘤模型BST739购自南京铁道医学院泌尿外科。BST739小鼠,雌性，体重18～

　　20g，购自中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心。

　　2　药物

　　NDV(Losota-4弱毒株）为冻干病毒疫苗，购自中国农业科学院兽药监察所。MMC和BCG临用前配制成浓度为1 mg/ml的溶液。

　　3　方法

　　3.1　体外实验步骤　将EJ细胞加入96孔培养板，每孔细胞约2×10³ 个，含培养液0.1 ml。NDV用培养液配制成1，10，100 mg/ml，将96孔细胞培养板内的细胞分为4组，待24 h细胞贴壁后吸出上清液，分别加入上述3个浓度的病毒各0.1 ml；对照组加入培养液0.1 ml。用同样方法将EJ细胞加入96孔板，NDV用培养液配制成10 mg/ml，BCG和MMC分别用培养液配制成1 mg/ml，待24 h细胞贴壁后吸出上清液，各组分别加入NDV，BCG和MMC各0.1 ml；对照组加入培养液0.1 ml。将配制的NDV 10 mg/ml与膀胱癌细胞共同培养5 d，进行透射电镜观察。

　　3.2　体内实验步骤　将小鼠膀胱肿瘤模型BST739瘤体均分为小块（直径约0.1 cm），接种于实验小鼠胸腹皮下。接种肿瘤d 2将25只带瘤小鼠分成5组，瘤体内分别注射生理盐水，NDV（100 mg/ml)，BCG（1 mg/ml) 及MMC（1 mg/ml)各0.1 ml，第5组于瘤体对侧皮下注射NDV 0.1 ml。另设一组5只小鼠提前于腹壁皮下注射NDV，3d后与其他5组小鼠同时接种肿瘤，隔日测量接种瘤体长径和短径，用公式计算肿瘤体积（肿瘤体积=1/2×长径×短径² ），并绘制瘤体生长曲线。观察11d后处死小鼠，取出瘤体进行称重，并进行病理观察。

　　4　统计分析

　　采用POMS软件对结果进行卡方检验。

　　结　　果

　　1　NDV对膀胱癌细胞的体外杀伤作用

　　1.1　不同浓度NDV对膀胱癌细胞杀伤作用的比较　结果显示10和100 mg/ml浓度组的作用相似，明显优于1 mg/ml浓度组（P＜0.01），见图1。

图1　不同浓度NDV对人膀胱癌细胞的影响

　　1.2　NDV，MMC和BCG对膀胱癌细胞的杀伤作用的比较　与对照组比较，3种药物在最适浓度下均能明显抑制膀胱癌细胞生长（P＜0.01)，其中NDV作用稍弱于MMC，强于BCG，见图2。

图2　3种药物对人膀胱癌细胞的影响

　　1.3　光镜及电镜观察结果　细胞与病毒混合培养5d后，大部分肿瘤细胞呈现生长状态差，部分细胞开始出现死亡。电镜观察发现肿瘤细胞胞浆内及细胞外均可见病毒颗粒，且有部分肿瘤细胞出现融合、老化表现。

　　2　NDV对膀胱癌细胞的体内杀伤作用

　　2.1　NDV，MMC和BCG对膀胱癌生长抑制作用的比较　3组药物对膀胱癌体内生长都有一定的抑制作用，其中MMC组与对照组之间比较P＜0.01,NDV组和BCG组与对照组之间比较P＜0.05，3组之间在统计学上差异不明显，见图3。

图3　3种药物对小鼠移植瘤的影响

　　2.2　瘤内、瘤对侧和肿瘤种植前注射NDV的结果比较　3组不同给药方法对膀胱癌体内生长都有一定的抑制作用，其中瘤内注射的效果优于瘤对侧注射和提前注射NDV病毒组。瘤内注射组与对照组之间比较P＜0.05，3组之间在统计学上差异不明显，见图4。

图4　瘤内、瘤对侧、提前注射NDV对小鼠移植瘤的影响

　　2.3　病理结果　瘤内注射NDV组和BCG组肿瘤细胞呈片状和结节状排列，细胞明显变性，肿瘤组织内见明显淋巴细胞浸润。瘤内注射MMC组肿瘤细胞呈片状坏死，未见淋巴细胞浸润。

　　讨　　论

　　早在50年代人们就开始尝试用病毒治疗恶性肿瘤，发现许多病毒对肿瘤细胞的感染和杀伤能力比对正常细胞强得多。病毒感染后可以增强肿瘤细胞抗原的呈递和表达，并可以诱导许多细胞因子的产生。自发现NDV具有抗肿瘤作用至今已有40余年的历史，90年代起国外屡有报道，采用NDV雾化吸入和肌肉注射等方法治疗晚期肺癌和消化道肿瘤等，并获得一定的疗效。

　　本实验初步探讨了NDV对膀胱癌的杀伤作用，并与BCG和MMC进行比较。体外实验主要反映的是药物对肿瘤细胞的直接作用，MMC显示了其作为一种有效的化疗药物对肿瘤细胞的直接破坏能力。NDV和BCG均为生物制剂，也显示了对肿瘤细胞的直接杀伤作用，且NDV的作用强于BCG。实验结果还提示NDV对膀胱癌的杀伤作用存在着一定的剂量效应关系。在体内实验中，基本上类似于体外实验的结果，3种药物均能明显抑制膀胱癌的体内生长，其中MMC效果优于NDV和BCG。提前注射和瘤对侧注射NDV对膀胱癌体内生长均有一定的抑制作用，提示NDV不仅对肿瘤有直接杀伤作用，并具有全身抗癌免疫机能调节作用。

　　自从发现NDV的抗瘤作用以来，对其作用机制的研究较多，综合诸多文献，考虑NDV抗瘤机制有以下可能^［2～5］：① 病毒可直接和特异地对肿瘤细胞产生细胞毒作用。② 病毒蛋白与肿瘤细胞膜碎片或完整的细胞相结合，提高了肿瘤抗原的免疫原性，从而增强宿主的细胞和体液免疫抗肿瘤的能力。③ 激活宿主免疫系统的各种细胞，增加其产生干扰素和TNF-α，IL-1，IL-6的能力。

　　本实验中，实验组肿瘤细胞较对照组呈现明显的生长状态不佳。肿瘤细胞与NDV共同培养5 d后电镜观察，肿瘤细胞内发现病毒颗粒，表明该病毒作用部位在胞浆内。体内实验中，接种瘤对侧注射NDV对肿瘤的抑制作用弱于直接瘤内注射组，瘤内注射组中肿瘤组织内有明显的淋巴细胞浸润，提示该病毒的局部作用在其对肿瘤的杀伤作用中是主要的，即免疫细胞浸润诱发的局部免疫抗瘤作用，而单纯的皮下注射引发的全身免疫抗瘤作用是次要的。

　　NDV抗瘤作用可归纳为2方面：一是局部作用，即对肿瘤细胞的直接杀伤和局部免疫作用；二是通过全身的免疫调节作用。其第二方面的作用，可能对预防膀胱肿瘤的复发，改善长期预后有一定的积极作用。NDV的免疫抗瘤作用，即对全身免疫系统进行监测和各种免疫因子检测等方面有待于进一步研究。

　　参考文献

　　1　Reichard KW, Lorence RM, Cascino CJ,et al. Newcastle disease virus selectively kills human tumor cells.J Surg Res，1992，52(5)∶448

　　2　Csatary LK, Sandor Eckhardt, Istran Bukosza,et al. Attenuated veterinary virus vaccine for the treatment of cancer.Cancer Detect Prev,1993，17(6)∶619

　　3　Shannon Kenney, Joseph S Pagano.Virus as oncolytic agents: a new age for“therapeutic”viruses?J Natl Cancer Inst,1994，86(16)∶1185

　　4　Lorence RM, Pamela A Rood, Keith W Kelley. Newcastle disease virus as an antineoplastic agent: induction of tumor necrosis factor-α and augmentation of its cytotoxicity.J Natl Cancer Inst,1988，80(16)∶1305

　　5　Csatary L,Gergely P.Vaccine therapy of malignant tumors.Orv Hetil,1990，131(47)∶2585

(收稿：1998-10-22　修回：1999-03-05)