高强度聚焦超声对人膀胱癌细胞周期分布的影响及联用甲氨喋呤的意义

中国超声医学杂志 2000年第10期第16卷 基础研究

作者：吴刚　杨光永　靳凤烁　李黔生　伍烽　王智彪

单位：吴刚　杨光永　靳凤烁　李黔生（400042　重庆市，第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科）；伍烽　王智彪（重庆医科大学医学超声工程研究所）

　　关键词： 超声；膀胱癌；细胞周期；甲氨喋呤

　　摘　要　目的：研究高强度聚焦(HIFU)超声对人膀胱癌细胞株T₂₄周期分布的影响及联合甲氨喋呤(MTX)的意义。方法：流式细胞仪(FCM)检测经HIFU(450w/cm²×6′)作用后残活细胞的周期分布；生长曲线观察HIFU联合MTX对T₂₄细胞生长增殖的影响。结果：经HIFU照射后3h残活细胞G₀%+G₁%下降，S%及G₂%+M%升高(P＜0.05)，24h后G₀%+G₁%进一步下降而S%进一步升高(P＜0.05)，120h后恢复正常(P＞0.05)；HIFU联合MTX对T₂₄细胞生长抑制作用明显强于单用HIFU、单用MTX。结论：在体外以空化、机械效应为主的HIFU可使T₂₄细胞周期分布发生可复性改变，联合MTX作用具有协同效应。

Effects of High Intensity Focused Ultrasound on Cell Cycle Distribution of Human Bladder　Cancer Cell and the Imports of Combination with Methotrexate

Wu Gang,Yang Guangyong,Jin Fengshuo,et al.

　　（Dept. Urology. Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042 China）

　　ABSTRACT　Objective:To study the effects of high intensity focused ultrasound(HIFU)on cell cycle distribution of human bladder cancer cell and the imports of combination with Methotrexate(MTX).Methods：Using flow cytometry(FCM)examined cell cycle distribution of survival T₂₄ cells which irradiated by HIFU(450w/cm²×6′). Observed cell growth curves of T₂₄ cells which acted by HIFU and MTX. Results:Through irradiation of HIFU, G₀%+G₁% of the survived cells decreased while S% and G₂%+M% increased 3h later(P＜0.05). S% further increased while G₀%+G₁% and G₂%+M% decreased 24h later(P＜0.05). Significant difference was not found between test group and control group 120h later(P＜0.05). HIFU(450w/cm²×6′)combined with MTX can halt T₂₄ cell growth stronger than HIFU alone or MTX alone.Conclusion:HIFU could change the T₂₄cell cycle distribution temporarily and combined MTX has sysnergistic inhibition effect.

　　KEY WORDS　Ultrasound　Bladder neoplasm　Cell cycle　Methotrexate

　　高强度聚焦超声(HIFU)是近年来兴起的微创治疗技术，其将高功率声波聚焦于深部病变组织，通过产生瞬态高温，空化及机械效应对靶组织造成不可逆的损伤而达到“深部切除”的治疗目的。目前该技术主要用于肿瘤的治疗，研究成果及应用前景令人鼓舞。瞬态高温效应是HIFU破坏肿瘤组织的主要机制，但空化、机械效应范围远大于高热效应范围，其对高温区边缘肿瘤细胞的作用更为重要。我们选用人膀胱癌细胞株T₂₄制成悬液，用体外实验方法摒除热效应作用，主要观察HIFU的空化、机械效应对T₂₄细胞、细胞周期分布的影响及联合甲氨喋呤(MTX)的意义。为进一步HIFU治疗肿瘤的研究提供理论与实验依据。

　　资料与方法

　　HIFU治疗系统样机：由重庆海扶技术有限公司研制。最大输出功率3000W，连续可调，探头系透镜聚焦原理制作而成，工作频率1.6MHz，直径12.0cm，聚焦深度10.3cm，物理学焦域1.1mm×1.1mm×3.3mm。

　　T₂₄膀胱癌细胞悬液制作及HIFU的照射过程：实验时采用常规培养处于指数增长期的T₂₄细胞，消化、充分吹打后制成浓度为1×10⁵／ml的细胞悬液分装于无菌聚乙烯试管(每管1.2ml)，加盖后置于三维移动支架上，37℃真空脱气水于试管外浸至悬液液平并且充盈于试管下端至HIFU探头之间，调整HIFU焦域使之定位于细胞悬液中央，启动治疗系统。所用实验照射时间均统一为6秒。

　　流式细胞仪(FCM)分析：细胞悬液经0W／cm²(对照)、450W／cm²的HIFU照射后各取一部分细胞静置3小时后离心(800转／分，10分钟)去上清，PBS液洗涤，收获以活细胞为主(95%以上)的细胞调浓度至10⁶个／ml，4℃下70%乙醇快速喷射固定。两组另一部分细胞分别继续培养，于24h、120h后用同样方法固定，上机检测得出细胞群体在各时相的分布比例。

　　细胞生长曲线的绘制：实验分为4组。A组：空化对照；B组：单用HIFU；C组：单用MTX；D组：HIFU+MTX。其中HIFU的声强为450W／cm²×6秒，MTX终浓度为4μg／ml，药物作用48小时。

　　根据文献^〔1〕记录的方法绘制两个阶段生长曲线，第一阶段(1～5天)，第二阶段(6～10天)。

　　结　果

　　HIFU作用对细胞周期分布的影响(表1，表2，表3)。

表1　HIFU作用后3h细胞周期分布与对照组比较

表3　HIFU作用后120h细胞周期分布与对照组比较

　　HIFU与MTX联合作用对细胞生长曲线的影响见图1，图2。

　　讨　　论

　　HIFU是通过聚能方式对肿瘤组织产生定点损伤，其中心区域温度最高，周围呈放射递减。Vallancien等^〔2〕证实HIFU能对前列腺组织内0.3～1cm范围升温至80℃以上而邻近4mm范围内则迅速降温至45℃以下。目前国际上主要通过三维移动探头，点阵排列高热损伤点来达到破坏肿瘤组织。但由于高热聚焦区域小、目前定位技术的困难及“损伤-损伤干扰”^〔3〕，常在高温区边缘会有残活细胞的存在。因空化、机械效应范围远大于热效应范围，这部分受到空化、机械效应而未受到高热效应的残存肿瘤细胞发生了何种生物学改变?这对指导HIFU完整破坏肿瘤及配合其他治疗有重要意义。

图1　第一阶段生长曲线

图2　第二阶段生长曲线

　　前期实验证实：声强小于1000W／cm²、作用时间小于10秒的HIFU不会对细胞悬液产生升温效应，其效应机制应以空化、机械效应为主；作用时间为6秒时，HIFU单次作用于1.2ml细胞悬液可对悬液内部绝大部分肿瘤细胞产生作用，450W／cm²为半致死剂量。对体外冲击波(HESW)影响肿瘤细胞周期的报道有较多争论^{〔4〕〔5〕}，这可能与不同的实验方法有关。HIFU是否能对肿瘤细胞的周期分布产生影响尚未见报道。HIFU辅以化学治疗如果是细胞周期特异性药物(CCSA)，了解HIFU作用后残存肿瘤细胞的周期分布变化至为重要。本实验经过检测受到HIFU的空化、机械作用后仍存活的肿瘤细胞于作用3h、24h、120h后的周期分布，发现：3h后细胞G₀+G₁期比下降，S期比及G₂+M期比升高；24h后G₀+G₁期比进一步下降，S期比进一步升高，G₂+M期则出现下降；120h后各期细胞比与对照组亦无显著性差异。分析可能原因为：(1)G₀+G₁期细胞对HIFU的作用较S期及G₂+M期细胞敏感，急性死亡的细胞中G₀+G₁期相对较多；(2)S期细胞对环境不利因素耐受较强，因而渐进性坏死的细胞中G₀+G₁期、G₂+M期相对较多而S期细胞较少；(3)HIFU可能造成S期某个阶段暂时受阻，这待进一步实验予以证实。

　　MTX是膀胱癌治疗常用药物之一，属细胞周期特异性药物(CCSA)，主作用于S期细胞。从实验中两个阶段生长曲线观察到，声强为450W／cm²的HIFU能明显增强MTX的抑制效应，这可能与HIFU作用导致T₂₄细胞S期比升高密切相关。HIFU治疗肿瘤配合MTX化疗具有积极意义。应该注意到，HIFU作用120h后残活细胞周期分布与对照已无显著性差异，提示HIFU治疗中辅以CCSA治疗时应注意给药的时序。

　　本项目受“九五”国家重点科技攻关项目基金(基金号：96-905-02-01)资助

参考文献

　　1，吴刚，杨光永，乔天愚等。高强度聚焦超声及其联合顺铂对人膀胱癌细胞的体外抑制效应。中国超声医学杂志，2000，16：321～324.

　　2，Vallancien G, Kastker EC, Chopin D, et al. focused extracorporeal pyrotherapy:Experimental results. Eur Urol, 1991,20:211～219.

　　3，Chen L, Rivens I, ter Haar GR, et al. Histological changes in rat liver tumours treated with high-intensity focused ultrasound. Ultrasound Med Biol, 1993,19:67～74.

　　4，Russo P, Stephenson RA, Mies C, et al. High energy shock waves suppress tumor growth in vitro and in vivo. J Urol 1986,135:626～628.

　　5，Kohn K. Cytocidal effect of high energy shock waves on tumor cells. Urol Res, 1990;18:101～103.

(2000-03-31收稿,199天刊出)