蝮蛇抗栓酶与肝素对膀胱肿瘤细胞与血小板粘附影响的实验研究

中华泌尿外科杂志 1999年第2期第20卷 论　　著

作者：赵建华　张绍增　任治国 王燕宁 何小英

单位：赵建华　张绍增　任治国　730050 兰州军区总医院泌尿外科，全军泌尿外科中心；王燕宁　输血科；何小英　药局

　　关键词： 膀胱肿瘤；癌；血小板粘附

　　【摘要】　目的　提高防治膀胱肿瘤复发和转移的效果。　方法　通过MTT法观察蝮蛇抗栓酶与肝素在体外抑制膀胱肿瘤BIU-87细胞系对血小板粘附的影响。　结果　蝮蛇抗栓酶组抑制膀胱肿瘤BIU-87细胞粘附血小板作用优于混合组(蝮蛇抗栓酶+肝素),混合组抑制作用优于肝素组。蝮蛇抗栓酶组、混合组和肝素组抑制作用明显优于空白对照组(t检验P＜0.01,P＜0.05)。　结论　蝮蛇抗栓酶与肝素临床综合用药对于防止膀胱癌细胞转移与复发具有重要意义。

The effect of ahylysantinfaretase on the adhesion

　　of bladder cancer cells to platelets

ZHAO Jianhua,ZHANG Shaozeng,WANG Yanning,et al

Department of Urology, General Hosptial of Lanzhou Command,PLA,Lanzhou 730050

　　【Abstract】　Objective　To elucidate the mechanism of the retarding effect of ahylysantinfaretase on the bladder cancer cells.　Methods　The human bladder transitional cell line BIU-87 was used in the study.The adhesion of the cancer cells to platelets was observed and studied by means of MTT colorimetry.　Results　The retarding effect on the adhesion of cancer cells to platelets was the strongest with ahylysantinfaretase even stronger than the combined use of ahylysantinfaretase and heparin while the combined use of the two being better than heparin alone.(P＜0.01,P＜0.05).　Conclusions　Ahylysantinfaretase might be effective for the prevention of recurrence and metastasis of bladder carcinoma.

　　【Key words】　Bladder neoplasms　　Carcinoma　　Platelet adhesiveness

　　自1968年Gasic等发现血小板与肿瘤转移的相关性之后,人们开展了大量的体内与体外研究,证明血小板有助于某些肿瘤转移的发生^［1］。Karpatkin等^［2］于1988年首先应用体外肿瘤细胞─血小板粘附实验,赵继懋等^［3］应用噻唑蓝(MTT)比色分析法观察了血小板功能状态对粘附的影响。我们在此基础上研究蝮蛇抗栓酶与肝素对膀胱移行细胞癌BIU-87粘附血小板的影响。报告如下。

　　材料与方法

　　一、主要材料

　　1.细胞株:BIU-87膀胱移行细胞癌细胞系由北京医科大学泌尿外科研究所惠赠。在CO₂恒温培养箱,RPMI 1640含10%胎牛血清细胞培养液培养,贴壁对数生长,0.5%胰酶和0.04% EDTA消化液分散细胞,磷酸缓冲液(PBS)制成细胞悬液待用。

　　2.血小板:由本院输血科提供健康献血员新鲜血小板浓缩液,EDTA/PBS液洗脱,使用血小板稀释液调成5×10⁸/ml,室温待用。

　　3.蝮蛇抗栓酶与肝素:均稀释为500U/ml,50U/ml,5U/ml,备用。

　　二、主要步骤

　　1.血小板铺板按文献方法^［1，2］,培养板置于4°C冰箱待用。

　　2.肿瘤细胞与血小板粘附试验按文献方法^［1-3］,将BIU-87细胞用含钙PBS稀释成5×10⁹/ml。将细胞悬液分为蝮蛇抗栓酶组、肝素组、蝮蛇抗栓酶与肝素混合组,另设一空白对照组。前3组再各分为3组，分别含蝮蛇抗栓酶500U/ml、50U/ml、5U/ml及肝素500U/ml、50U/ml、5U/ml及各含蝮蛇抗栓酶250U/ml与肝素250U/ml,蝮蛇抗栓酶25U/ml、肝素25U/ml,蝮蛇抗栓酶2.5U/ml和肝素2.5U/ml。将各组细胞悬液5ml放入含有血小板的培养板中，CO₂恒温培养箱37°C,1小时培养。

　　3.MTT法比值:洗去培养板中未粘附的肿瘤细胞,加MTT(1mg/ml)50μl/孔,于37°C中孵育1.5小时,取出培养板加二甲基亚砜(DMSO)200μl/孔,置于37°C,30分钟,取出培养板振荡后静置2分钟，用紫外分光光度计测各孔吸光度(A)值(波长492nm)。

　　结　　果

　　一、蝮蛇抗栓酶与肝素对BIU-87细胞粘附的影响结果见表1

表1　蝮蛇抗栓酶与肝素对BIU-87细胞粘附的影响(吸光度A值)

　　5U/ml肝素组与混合组(蝮蛇抗栓酶和肝素各2.5U/ml)经t检验P＞0.05，差异无显著性,余相同浓度各组之间,同组不同浓度之间差异均有显著性(P＜0.01，P＜0.05)。　　二、用药浓度与吸光度A值的关系

　　蝮蛇抗栓酶组抗血小板与BIU-87细胞粘附强于肝素组与混合组,经t检验3组之间差异均有显著性(P＜0.05,P＜0.01)。混合组抗粘附能力强于肝素组(P＜0.05)。3组亦显示随着用药浓度降低，A值逐渐增高,即药物抗粘附能力逐渐减低。3组相对于空白对照组差异均有显著性(P＜0.01)。

　　讨　　论

　　肿瘤转移为恶性肿瘤致死的关键因素,亦是一个复杂的多环节过程，现已证实此过程细胞粘附分子起重要作用。最近发现粘附分子受体(P-selectin,E-selectin,L-selectin)能介导血小板和内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞及肿瘤细胞之间相互作用,它们在炎症、血栓形成以及肿瘤转移等过程中起着重要作用。其中肿瘤细胞恶性生长并从原发灶中脱离为肿瘤转移的关键,而肿瘤细胞与内皮细胞、细胞外基质粘附为癌血行转移不可缺少的环节,肿瘤细胞在血循环中与血小板等结合可使癌细胞免受吞噬细胞等的清除^［4-6］。Stone等^［7］研究发现,肝素、岩藻糖、硫酸粘多糖能抑制P-selectin介导的血小板与肺癌和神经母细胞瘤细胞株结合。而蝮蛇抗酸酶其药理机制显示能明显降低血液粘度,减少血小板数量,抑制其粘附和聚集功能^［8］。本试验结果发现,3试验组随着药物浓度降低,吸光度值增高，即抑制血小板与BIU-87细胞粘附能力逐渐下降,提示蝮蛇抗栓酶和肝素能够抑制膀胱肿瘤患者癌细胞的复发和远处转移,这对于癌症患者术前、术后综合用药防止癌细胞转移与复发及提高癌症患者生存率方面具有重要意义。一些研究结果表明,在施行经尿道膀胱肿瘤电切时,可有大量存活的癌细胞脱落到膀胱内液体中,这些癌细胞粘附到损伤的尿路上皮是导致肿瘤复发原因之一^［9，10］。人们是否能在电切时加入蝮蛇抗栓酶与肝素液体冲洗，以此来减低其复发与转移,尚有待于进一步研究。

　　《参考文献》

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　　metastase following infection of CT26 colon adenocarcinoma, Lewis lung carcinoma and B16 amelanotic

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　　[2]　Karpatkin S,Pearlstein E,Ambrogio C,et al.Role of adhesive proteins in platele tumor interaction in vitro

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　　[3]　赵继懋,顾方六,蔡碧涓.高转移和低转移前列腺癌株细胞与血小板体外粘附. 中华泌尿外科

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(收稿：1998-03-30　修回：1998-10-23)