良恶性骨肿瘤p27蛋白表达与DNA含量研究

中国肿瘤临床 2000年第3期第27卷 论　著

作者：曾建成　胡云洲　裴福兴　雷松　毛咏秋　魏于全

单位：曾建成(华西医科大学附属第一医院骨科　成都市　610041)；胡云洲(华西医科大学附属第一医院骨科　成都市　610041)；裴福兴(华西医科大学附属第一医院骨科　成都市　610041)；雷松（肿瘤生物治疗研究中心）；毛咏秋（肿瘤生物治疗研究中心）；魏于全（肿瘤生物治疗研究中心）

关键词：p27；基因表达；骨肿瘤；DNA；流式细胞术

　　摘要　目的：探讨良恶性骨肿瘤细胞p27蛋白表达与DNA含量的关系及意义。方法：取骨肿瘤新鲜标本52例(骨软骨瘤10例，骨巨细胞瘤10例，骨肉瘤20例，其他恶性骨肿瘤12例)，运用流式细胞术、单克隆抗体技术和定量免疫荧光技术，检测瘤细胞p27蛋白表达、S期细胞百分数(SPF)及DNA含量(DI)，分析三者之间的关系。结果：52例骨肿瘤p27蛋白表达的平均FI值为1.37(骨软骨瘤2.24±0.38，骨巨细胞瘤1.79±0.36，骨肉瘤1.06±0.39，其他恶性骨肿瘤1.01±0.45)；p27＜1.37组25例，均为恶性骨肿瘤；p27＜1.37组的DI、SPF均明显高于p27≥1.37组(P＜0.001)。结论：p27蛋白表达减少，导致细胞周期失调，S期细胞增多，DNA合成增强，细胞过度增生、恶变，可能是骨肿瘤发生发展的原因之一。

　　The Significance of p27 Expression and DNA Content in Benign

　　and Malignant Bone Tumors

Zeng Jiancheng　Hu Yuzhou　Pei Fuxing

　　（Department of Orthopedics, First affiliated Hospital of Huasi Medical

　　University, Chengdu）

　　Abstract　Objective：To explore the relationship between p27 expression and DNA content in benign and malignant bone tumors and its clinical significance.Methods：The expression of p27, S-phase fraction (SPF) and DNA content in 52 fresh specimens of bone tumors confirmed by pathology (osteochondroma 10,giant cell tumor of bone 10, osteosarcoma 20 and other malignant bone tumors 12) were measured by flow cytometry and quantitative immunofluorescence and the correlation of them was analysed.Results：The mean fluorescence index (FI) of p27 protein in52 cases was 1.37 (osteochondroma 2.24±0.38, giant cell tumor of bone 1.79±0.36 ,osteosaercoma 1.06±0.39 and other malignant tumors 1.01±0.45). Twenty-five cases with p27 lower than 1.37 were all malignant bone tumors. DNA index (DI) and SPF in the group with p27 lower than 1.37 were far higher than that of the group with p27 higher than or equal to 1.37 (P＜0.001).Conclusion：We suggest that low expression of p27 protein may lead to abnormality of cell cycle, while increase of S-phase cells, synthesis of DNA and hyperproliferation and malignant change of cells would be one of the causes of tumorigenesis of bone tumor.

　　Key Words　p27　Gene expression　Bone neoplasm　Flow cytometry

　　为了更深入地了解良恶性骨肿瘤细胞增殖动力学特点和生物学行为，指导临床诊断治疗及预后判断，我们利用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)、单克隆抗体技术和定量免疫荧光技术，对手术或活检所得的人骨肿瘤新鲜标本进行了瘤细胞DNA含量、细胞周期和p27蛋白表达的定量分析，对三者的关系及意义进行了探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　标本　取自华西医科大学附属第一医院骨科1997年6月至1998年6月手术或活检所得的人骨肿瘤新鲜瘤组织标本(均经本院病理科组织切片证实诊断)共52例：骨软骨瘤10例，骨巨细胞瘤10例，骨肉瘤20例，骨恶性纤维组织细胞瘤5例，软骨肉瘤5例，骨纤维肉瘤2例。所有病例均为无转移的原发骨肿瘤，在院外未行化疗及手术等处理。

　　1.1.2　试剂　碘化丙啶染液(PI，50μg/ml)，0.5%Triton X-100(Sigma公司)。鼠抗人p27蛋白单克隆抗体(一抗)，羊抗鼠异硫氰基荧光素-IgG(FITC-IgG,二抗)系Immunotech公司产品。

　　1.1.3　流式细胞仪　美国Coulter公司生产的Elite Esp型，其光源为Ar⁺激光器，激发光波长为488nm。

　　1.2　实验方法

　　1.2.1　骨肿瘤细胞DNA含量及细胞周期分析：将瘤组织用PBS液漂洗，去除表面血污及脂肪、结缔组织后，切割成1mm³大的碎块，装入试管中，加入30倍体积0.05%胶原酶，置37℃水浴中消化60分钟，间断振荡数次。终止消化后，用100目网眼的筛网过滤，去除未消化的组织，收集细胞悬液于离心管中。1 200rpm离心5分钟，去上清液；加入PBS液漂洗、离心，800rpm，3分钟，共两次，以除去细胞碎片。用300目筛网过滤，去除粘连细胞。用PBS液调整细胞浓度至1×10⁶个/ml。加入DNA结合性荧光染料PI染液(50μg/ml)1ml，染色30分钟。流式细胞仪检测瘤细胞DNA含量及G₁/G₀期、G₂/M期、S期百分数(S-phase fraction,SPF)。检测前先用标准微球(DNA Check)校准仪器，使其CV值在5%以内，并检测正常人外周血淋巴细胞作为DNA含量标准对照。检测时每个样品测5 000个细胞，其荧光信号经流式细胞仪Multicycle细胞周期分析软件处理后以直方图和数据表方式在荧光屏上显示。

　　1.2.2　p27蛋白表达的检测　将瘤组织用生理盐水反复洗涤3次(去除红细胞)，3%多聚甲醛固定10小时(4℃冰箱存放)。弃甲醛，PBS洗涤1次后，超声振荡器处理5分钟(使细胞分散)。加入0.5%TritonX-100 2ml，室温处理20分钟。用PBS洗涤3次，离心弃上清液，调整细胞浓度至1×10⁶个/ml。细胞样品40μl，加入1∶5一抗10μl(对照组不加一抗)，37℃孵育1小时。加入2%小牛血清白蛋白50μl，室温作用20分钟，封闭无关抗原。PBS洗涤3次。加入荧光标记的二抗50μl(1∶50)，37℃孵育1小时。PBS洗涤3次，离心弃上清液。流式细胞仪检测瘤细胞的荧光强度，每个样品测5 000个细胞，用 Elite分析软件分析处理。

　　1.3　资料统计分析方法

　　1.3.1　DNA含量表示法　瘤细胞DNA含量以DNA指数(DNA Index,DI)表示。

　　以DI值作为判定DNA倍体的标准：DI=1.0±2CV，即0.90-1.10为二倍体；超出此范围者为异倍体。

　　1.3.2　细胞周期计算方法　由计算机的Multicycle周期分析软件确定G₀/G₁期、S期、G₂/M期的道次范围后，计算落在各期内的细胞数总和即得各期细胞数，并用百分率表示。其中S期百分数(S-phase fraction)用SPF表示。

　　1.3.3　p27蛋白表达的定量分析　以荧光指数(fluorescence index,FI)表示p27蛋白的相对含量。

　　1.3.4　统计处理　测得的数据用均数()±标准差(s)表示。所有数据均采用SAS V6.12统计软件处理，行t检验或q检验。

　　2　结果

　　2.1　骨肿瘤良恶性与DNA倍体、DNA含量(DI)、S期百分数(SPF)和p27蛋白表达的关系

　　20例良性骨肿瘤均为二倍体，32例恶性骨肿瘤仅3例为二倍体，其余29例均为异倍体。恶性骨肿瘤的DI值、S期细胞所占百分比均明显高于良性骨肿瘤，但p27蛋白表达水平却明显低于良性骨肿瘤。良恶性骨肿瘤之间DI值、SPF、p27蛋白表达的差异，经统计学处理，有显著意义(表1)。

表1　骨肿瘤良恶性与DNA倍体、DI、SPF和p27的关系

　　 2.2　骨肿瘤的病理类型、恶性程度与DI、SPF、p27的关系

　　骨软骨瘤、骨巨细胞瘤、骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤之间比较结果显示：骨肿瘤的恶性程度越高，瘤细胞DNA含量和S期细胞所占比例越高，p27蛋白表达水平却相应降低。经多样本均数两两比较的q检验，它们之间的差异(骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤之间的差异除外)有显著性(表2)。

表2　骨肿瘤的病理类型、恶性程度与DI、SPF、p27的关系

　　 2.3　p27蛋白表达与DNA含量、SPF的关系

　　52例骨肿瘤p27蛋白表达的平均FI值=1.37。以=1.37为界限，将52例骨肿瘤分成两组：p27≥1.37组，27例(骨软骨瘤10例，骨巨细胞胞瘤10例，骨肉瘤3例，骨恶性纤维组织细胞瘤1例，骨软骨肉瘤3例)；p27＜1.37组，25例，均为恶性骨肿瘤。比较发现，p27＜1.37组的DI、SPF值均明显高于p27≥1.37组，两组之间的差异有显著性(P＜0.001)，见表3。

表3　p27蛋白表达与DI、SPF的关系

　　3　讨论　　肿瘤的发生、发展和恶变与细胞周期失控密切相关。细胞周期的顺利进行和完成依赖于一系列正负调节因子的相互作用，主要有细胞周期素(cyclins)、细胞周期素依赖激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)和细胞周期素依赖激酶抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase inhibitors,CDKIs)。CDKIs是近几年来分离得到一类重要的细胞周期调控蛋白，参与细胞G₁期进入S期的负调控，可防止细胞过度增殖和恶变^［1］。

　　p27是新近发现的CDKIs家族成员之一^［2，3］。p27基因位于12p12-13.1，其编码的p27蛋白可抑制细胞从G₁期进入S期而参与细胞周期的调控^［4～6］。Loda^［7］通过对结直肠癌p27蛋白表达的研究发现：p27蛋白低表达或不表达的患者的生存期明显低于p27蛋白阳性表达者；p27蛋白低表达或不表达主要是由于p27蛋白降解加强所致，p27基因缺失、突变少见；p27蛋白降解增加，引起p27蛋白低水平是侵袭性肿瘤发生的原因之一。Porter^［8］、Steeg^［9］等也认为p27蛋白水平的改变与肿瘤的发生、发展有关，可作为肿瘤生物学行为的预测指标。

　　本研究对骨软骨瘤、骨巨细胞瘤、骨肉瘤和其他恶性骨肿瘤DNA含量、SPF和p27蛋白的流式定量分析结果表明：骨肿瘤的恶性程度越高，瘤细胞的p27蛋白表达水平越低，瘤细胞DNA含量(DI)和S期细胞百分比却相应增高。骨肿瘤细胞的DI和SPF值的高低与p27蛋白表达水平有一定的相关性。由此可以推测，p27蛋白可能与骨肿瘤的发生、发展、恶变及预后有关。p27蛋白表达减少，导致细胞周期失调，S期细胞增多，DNA合成增强，细胞过度增生，可能是骨肿瘤发生、发展、恶变的原因之一。

　　利用流式细胞术定量分析骨肿瘤细胞DNA含量、S期细胞百分比与p27蛋白表达，将有助于骨肿瘤生物学行为和细胞增殖动力学特点的认识，对骨肿瘤良恶性鉴别、治疗方案的制定和预后的推断均有一定的临床意义。

　　基金项目：本文课题受四川省卫生厅科学研究基金资助

　　参考文献：

　　1，Hunter T,Pines J.Cyclins and cancer Ⅱ：cyclin D and CDK in-hibitors come of age.Cell,1994;79：573～82

　　2，Polyak K,Lee MH,Bromage HE,et al.Cloning of p27^Kip1,a cycl in-dependent Kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals.Cell,1994;78：59～66

　　3，Toyoshima H,Hunter T.p27,a novel inhibitor of G₁ cyclin-CDK protein kinase activity,is related to p21. Cell,1994;78：67～74

　　4，Pietenpol JA,Bohlander SK,Sato Y,et al.Assignment of the human p27^Kip1 gene to 12p13 and its analysis in leukemias.Cancer Res,1995;55：1206～10

　　5，Ponce-Castaneda MV,Lee MH,Latres E,et al.p27^kip1：chromoso mal mapping to 12p12-12p13.1 and absence of mutations in human tumors.Cancer Res,1995;55：1211～4

　　6，Hengst L,Read SI.Translational control of p27^kip1 accumulation during the cell cycle.Science,1996;271：1861～4

　　7，Loda M,Cukor B,Tam SW,et al.Increased proteasome-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas.Nat1 Med,1997;3(2)：231～4

　　8，Porter PL,Malone KE,Heagerty PJ,et al.Expression of cell-cycle regulators p27^kip1 and cyclin E,alone and in combination,correlate with survival in young breast cancer patients.Nat1 Med,1997;3(2)：222～5

　　9，Steeg PS, Abrams JS. Cancer prognostices： past, present and p27.Nat1 Med,1997;3(2)：152～4

收稿日期：1999-03-22