抑制cyclinD1表达对乳腺癌细胞增殖及cyclinE、CDK2和p21^cip1转录的影响

解剖学报 2000年第3期第31卷 论著

作者：桑建利　叶颖江　王永潮

单位：桑建利（北京师范大学生命科学学院细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京　100875）；叶颖江（北京医科大学第二附属医院普外科，北京　100044）；王永潮（北京师范大学生命科学学院细胞增殖及调控生物学开放实验室，北京　100875）

关键词：乳腺癌；细胞增殖；cyclinD1；CDK2；p21cip1

　　　　【摘要】　目的　分析探讨人乳腺癌细胞中cyclinD1的表达受到反义RNA抑制后，细胞增殖能力的变化以及cyclinE,CDK2和p21^cip1(cip1／waf1／sdi1)基因表达受到的影响。　方法　将表达cyclinD1反义RNA的重组质粒转入人乳腺癌细胞，由此抑制细胞中cyclinD1的表达，然后分析细胞生长速率和各时相细胞分布比例的变化，并通过Northern blot分析有关基因的表达水平。　结果　cyclinD1表达受到抑制的细胞与对照相比，细胞增殖速率明显下降，培养至第6d时，生长抑制率为54%。细胞周期各时相的分布比例也有较大的变化，G1期细胞比例上升，而S期及G2／M期细胞比例下降。cyclinE和CDK2的mRNA水平显示出有不同程度的下降，而p21^cip1的表达无明显变化。　结论　cyclinD1表达的抑制可明显减弱人乳腺癌细胞的异常增殖，同时表明同为细胞周期调控基因的cyclinE和CDK2的表达与cyclinD1的表达密切相关，而p21^cip1的表达不受cyclinD1的影响。

　　【中图分类号】　Q28；R329　【文献标识码】　A　【文章编号】　0529-1356(2000)03-221

INHIBITION EFFECT OF cyclinD1 ON CELL PROLIFERATION AND

　　TRANSCRIPTION OF cyclinE, CDK2 AND p21^cip1

　　IN HUMAN BREAST CANCER CELL LINE

SANG Jian-li　YE Ying-jiang　WANG Yong-chao

　　Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology, College of Life Science,Beijing Normal University, Beijing　100875, China

　　General Surgerg,the Second Hospital,Beijing Medical University,Beijing　100044, China

　　【Abstract】　Objective　　To study the changes of cell proliferation and the effects on transcription of cyclinE, CDK2 and p21^cip1(cip／waf1／sdil) when cyclinD1 was inhibited by antisense RNA in human breast cancer(Bcap-37). Methods　The recombinant vector expressing cyclinD1 antisense RNA was transfected into the cells to inhibite the expression of cyclinD1, then the rate of cell proliferation and distribution of different phase of cell cycles were measured. At the same time the transcription of cyclinE, CDK2 and p21^cip1 were analyzed by Northern blot.Results　As comparing the cells in which cyclin D1 was inhibited with control cells, the cell proliferation reduced markedly, the radio of growth inhibition was about 54% at the sixth day in assay of cell growth. The changes of distribution of phases in cell cycle were oberved. The proportion of cells in G1 phase increased while the proportion of cells in S and G2／M phase decreased. The levels of cyclinE and CDK2 mRNA fell to a certain extent and expression of p21^cip1 did not show apparent change.Conclusion　The inhibition of cyclinD1 lessens abnormal cell proliferation of human breast cancer. The expressions of cyclinE and CDK2 as the genes in cell cycle control have close relationship with that of cyclinD1 while the expression of p21^cip1 is not affected by cyclinD1.

　　【Key words】　Breast cancer; Cell proliferation; cyclinD1; CDK2; p21^cip1　　自从cyclin和CDK基因被发现后，对于它们在细胞周期调控中的作用已有大量深入的研究。现已证实，细胞周期的进程受到cyclin和CDK基因的调控，当cyclin与CDK的蛋白质产物形成有活性的蛋白激酶复合体时，便可启动细胞周期并且促进周期中不同时相的转换^［1］。随着对细胞周期调控的研究，又发现了CDK抑制因子(CKI)的存在，这些因子能够与cyclin／CDK蛋白激酶复合体结合而抑制酶的活性。p21^cip1是CKI中发现较早、作用较广泛的一种^［2］。在对细胞周期调控机制研究的同时，人们意识到调控细胞周期的基因有可能在肿瘤细胞的发生与发展中起重要作用，正因为如此，近年来对于cyclin、CDK和p21^cip1在肿瘤细胞中异常表达的研究受到广泛重视^［3—6］。本研究中，利用cyclinD1反义RNA抑制此基因的表达，观察分析了cyclinD1受到抑制后，对人乳腺癌细胞增殖的影响，以及对同属于细胞周期调控基因的cyclinE、CDK2和p21^cip1表达的影响。由此，不仅进一步探讨了cyclinD1与乳腺癌异常增殖的相关性，同时，分析了cyclinD1与其他细胞周期调控基因在表达上的关联。

　　材料和方法

　　1.细胞培养

　　人乳腺癌细胞系Bcap-37来自北京医科大学第二附属医院妇科肿瘤研究所。细胞培养基为PRMI1640加10%小牛血清，在37℃含5%CO₂培养箱中培养。

　　2.cyclinD1反义RNA真核细胞表达载体的构建及细胞转染

　　本研究中所用的cyclinD1基因cDNA、CDK2基因cDNA由美国Cold Spring Harbor实验室的David Beach博士惠赠，cyclinE基因cDNA由美国Scripps研究所的Steve Reed博士惠赠，p21^cip1基因cDNA由中国科学院水生生物研究所的桂建芳博士惠赠，真核细胞表达载体pXJ41-neo由新加坡国立大学王跃博士惠赠。用限制性内切酶E.CoRI将cyclinD1 cDNA从原质粒(puc118)上切下，并分离纯化，同时用相同的酶切表达载体pXJ41-neo，然后将cyclinD1 cDNA片段连接到表达载体中，利用cyclinD1序列和载体多克隆位点中HindIII酶切位点，筛选出表达反义RNA的重组质粒(图1)。细胞转染采用磷酸钙共沉淀法。

　　3.细胞生长曲线测定

　　取对数生长期细胞，将其密度稀释成10⁴个／ml，于6孔板中培养，每24h取1次样，每次每个样品取3个孔的细胞，每个孔的细胞密度计数3次，计数后取平均数，连续测定6次样，并绘制成曲线。

　　4.流式细胞光度术分析

　　取对数生长期细胞，用75%乙醇固定过夜，PBS洗2次后加入RNaseA(100mg/L)37℃保温30～60min，用碘化丙啶(prpidium iodide,PI 50mg/L)在冰上避光染色30min，细胞经尼龙网过滤后，在自动流式细胞分析仪上测定。

　　5.Northern blot分析

　　采用硫氰酸胍-酚-氯仿法提取细胞总RNA^［7］，在1.2%的甲醛变性琼脂糖凝胶中电泳，首先配制的凝胶在80V电压下预电泳5min，点样后将电压调至56V，电泳约1.5h时，将前后电极液适当混合，约3h结束电泳。在紫外光下迅速观察胶中各样的18S和28S rRNA带，判断RNA的完整性和样品量的均一性，并作为各样品的内对照。杂交探针是体外转录的各基因片段的反义RNA，并用含³²P的UTP标记。凝胶中的RNA通过真空转移装置转移到尼龙膜上，80℃烤膜2h，然后进行预杂交，杂交、洗膜与曝光。整个过程各步骤所使用的试剂和具体操作均参考《分子克隆实验指南》^［8］中所提供的方法。

图1　cyclinD1反义RNA真核表达载体

Fig.1　Eukaryotic expression vector of cyclinD1 antisense RNA

　　结　果

　　1.表达cyclinD1反义RNA人乳腺癌细胞模型的建立

　　采用磷酸钙共沉淀法，分别将表达cyclinD1反义RNA的重组质粒和空载体质粒转入人乳腺癌细胞Bcap-37中，将被转染的细胞培养于含G418(200mg/L)的培养基中，经过筛选得到阳性细胞克隆。然后利用原位杂交方法对阳性细胞克隆做进一步的鉴定，首先利用地高辛RNA标记试剂盒，在T₇RNA聚合酶的作用下，转录出带有地高辛标记的cyclinD1正义链RNA作为探针，对筛选出的G418抗性细胞进行原位杂交检测，原位杂交主要包括细胞的固定，预处理，预杂交，杂交，洗片与显色反应等过程，具体操作按照《原位杂交》^［9］中的方法进行，结果显示筛选出的细胞呈阳性显色反应，表明细胞中有cyclinD1反义RNA表达，而对照细胞为阴性显色反应(图2)。这样建立了表达cyclinD1反义RNA的细胞模型，可用于研究cyclinD1表达受到抑制后，人乳腺癌细胞增殖能力的变化，以及cyclinE，CDK2和p21^cip1在转录上是否受到影响。

图2　利用原位杂交鉴定表达cyclinD1反义RNA的细胞　×400

　　a.表达cyclinD1反义RNA的细胞　b.对照细胞

　　Fig.2 Detection of cells expressing cyclinD1 antisense RNA by in situ hybrydization　×400

　　a,cells expressing cyclinD1 antisense RNA;　b,control cells

　　2.抑制cyclinD1表达对人乳腺癌细胞增殖的影响

　　首先测定了细胞的生长速率，主要是根据细胞密度绘制成细胞生长曲线(图3)。结果显示，cyclinD1表达受到抑制后，细胞生长速率明显减慢。随培养时间延长，细胞生长受抑制的程度不断增大，培养至第6d时，细胞生长抑制率为54%。通过t检验可知，两种细胞的密度呈极显著差异(P＜0.001)。流式细胞光度术的分析结果也表明cyclinD1受到抑制后，细胞增殖能力下降。比较各时相细胞所占的比例，G1期细胞增加了17个百分点，S期细胞下降了6个百分点，G2／M期细胞下降了11个百分点(图4)。

图3　细胞生长速率比较

　　Fig.3　Comparision of cell growth ratio between two cell lines

　　3.抑制cyclinD1的表达对cyclinE、CDK2和p21^cip1转录的影响

　　分别从cyclinD1受抑制的细胞和对照细胞中提取RNA，对cyclinE、CDK2和p21^cip1的转录进行了Northern blot分析(图5)。比较分析结果可以看出，由于cyclinD1受到抑制，cyclinE和CDK2的转录水平有不同程度的下降，而p21^cip1mRNA的水平未见明显变化。这表明cyclinE和CDK2的转录与cyclinD1的表达水平有着明显关系，而p21^cip1的转录不受cyclinD1表达水平的影响。

图4　细胞周期时相分布的流式细胞术分析

　　(a) cyclinD1表达受到抑制的细胞　(b)对照细胞

　　Fig.4　Flow cytometry analysis of phase destribution in cell cycle

　　a,Cell in which cyclinD1 was inhibitied　b,Control cell

图5　基因表达的Northern blot分析

　　1.cyclinE　2.CDK2　3.p21^cip1

　　a.cyclinD1表达受到抑制的细胞

　　b.对照细胞

　　Fig.5　Northern blot analysis of

　　gene expression

　　1.cyclinE　2.CDK2　3.p21^cip1

　　a.cells in wich cyclinD1 was inhibited

　　b.control cells

　　讨论

　　细胞周期的启动与进程受到cyclin和CDK基因的严格调控，cyclinD1与CDK4的蛋白产物形成蛋白激酶复合体，主要参与细胞G1期限制点的调控，决定着细胞是否能进入分裂周期，所以它是一个调控细胞增殖的关键性的基因^［1］。由于增殖失控是癌细胞的一个主要特征，因此，近些年里对癌细胞中cyclin基因的各种变异进行了广泛的研究。现已在包括乳腺癌在内的多种癌细胞中发现了cyclin基因的扩增与过表达，特别是cyclinD1基因的扩增与过表达较为普遍，甚至将它作为一个新的细胞原癌基因^［10］。

　　通过将cyclinD1表达受到抑制的细胞与对照细胞的生长速率相比较，得知其细胞生长速率明显下降，培养至第6d时，生长抑制率为54%。流式细胞光度术的分析结果也显示出，由于cyclinD1表达受到抑制，细胞周期各时相的细胞所占比例发生明显变化，G1期细胞的比例由40%上升到57%，S期细胞的比例由48%下降到42%，G2／M期细胞的比例由12%下降到1%。G1期细胞数的增加以及S期和G2／M期细胞数的减少，表明了细胞增殖能力的下降。在cyclinD1与细胞癌变相关性的研究中，已发现在由生长因子和甾类激素刺激的乳腺癌细胞分裂中，cyclinD1是早期诱导表达的关键基因，在通过抑制雌激素而抑制细胞生长的实验中，cyclinD1也是早期反应的基因^［11］.Wang等^［12］通过将高表达cyclinD1的质粒转入鼠细胞，观察到cyclinD1的过表达可导致细胞的异常增殖，并对乳腺肿瘤的形成有促进作用。还有人将cyclinD1抗体注入癌细胞，结果使细胞的增殖受到明显抑制^［13］。至于cyclinD1的过表达已在多种癌细胞中被检测到^［5，6］。在本研究中，利用反义RNA抑制cyclinD1表达，然后分析细胞增殖能力的变化，通过这种方式进一步确定了cyclinD1与癌细胞异常增殖间的密切关系，这与已有的研究结果是相一致的。同时，也由此探讨了通过抑制cyclinD1的表达而阻止癌细胞异常增殖的可能性。尽管细胞的癌变包括多个基因变异，并由多个步骤形成，可以推测cyclinD1基因的变异无疑是其中一个主要的步骤。

　　在对细胞增殖能力变化进行分析的同时，本研究对cyclinD1表达受到抑制后，同为周期调控基因的cyclinE和CDK2以及p21^cip1的转录水平进行了分析，探讨了它们在表达上的相互关系。分析结果显示，cyclinD1表达受到抑制后，cyclinE和CDK2的mRNA水平均有不同程度的降低，而作为CDK抑制因子的p21^cip1的转录水平未受影响。G1期不同的cyclin和CDK基因以及p21^cip1基因在细胞周期调控中的作用顺序与方式已有较多的研究，但对于它们之间在表达上的关系研究甚少。然而，对这一问题的研究将有助于深入认识周期调控的机理，以及这些基因在细胞癌变中的作用。在本研究中，当cyclinD1表达受到抑制时，cyclinE和CDK2的表达水平随之下降，这表明在细胞周期调控中，cyclinD1表达受到抑制不仅会由于cyclinD1与CDK4蛋白激酶复合体量的减少，而使细胞难以通过G1期限制点，而且还使位于其后负责G1／S期转换的cyclinE与CDK2合成也受到限制，推测这种机制可保证细胞周期受到更精确的调控。

　　p21^cip1是一种作用广泛的CDK抑制因子，它通过与cyclin／CDK蛋白激酶复合体相结合而抑制酶的活性，所以它是细胞周期的负调控因子。p21^cip1可通过p53依赖性和非依赖性两条途径产生，当细胞受到损伤，开始分化或进入衰老等状态时，p21^cip1会阻断细胞周期，使细胞不再增殖，所以它也被认为是一种潜在的抑癌基因。关于cyclinD1与p21^cip1在表达上的关系，目前发现当通过野生型p53表达来阻止细胞生长时，会同时诱导细胞中cyclinD1和p21^cip1的表达^［14］，此外，还有实验表明在胰腺癌细胞中出现cyclinD1与p21^cip1同时高表达的现象^［15］，但是，p21^cip1的表达是否直接受到cyclinD1表达的影响(缺乏这方面的研究)。在本研究中，cyclinD1表达受到抑制后，p21^cip1表达水平无明显变化，推测cyclinD1对p21^cip1的表达无直接调控作用。

　　【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39430080)，教育部留学回国人员科研启动基金资助项目

　　【作者简介】　桑建利(1956—)，男，山西省人，博士，副教授

　　通讯作者(To whom correspondence should be addressed)

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　　【收稿日期】1999-04-30　【修稿日期】1999-12-24