RT－PCR方法对检测乳腺癌干细胞富集血残存肿瘤细胞的价值

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第10期

李慧　邵莹　张澎　安秀梅　郝希山

　　　摘　要　目的：旨在用敏感的RT－PCR方法扩增目的基因，用于检测干细胞富集血中残存的肿瘤细胞。方法：应用RT－PCR方法检测样品MUC1、K19基因的表达情况。结果：乳腺癌细胞系MCF－7中MUC1、K19表达阳性，而在淋巴细胞中则未见有表达。进一步用淋巴细胞稀释乳腺癌细胞来检测该方法的灵敏度。MUC1、K19检测残存肿瘤细胞的灵敏度均达到1/10⁵。在此基础上，完成了15例乳腺癌患者干细胞富集血检测工作。结论：RT－PCR是检测残存肿瘤细胞检测中行之有效的方法。

　　关键词：乳腺癌 自体外周血干细胞移植　微小残存病　RT－PCR

　　随着乳腺癌治疗方法的进展和外周血干细胞移植治疗肿瘤新技术的问世，乳腺癌的综合治疗有了很大发展^[1,2]。但干细胞富集血中残存的肿瘤细胞的存在是对肿瘤患者进行自体干细胞移植必需解决的问题。我们将分子生物学检测方法引入到血中残存瘤细胞的检测中，监控微小转移灶，提高移植的安全性，延长生存期。

　　检测富集血中的残存肿瘤细胞，有两方面的问题亟待解决。一是要有肿瘤特异性的生物标记；二是灵敏度高的实验方法，能从大量的血中检测出极微量的肿瘤细胞。近几年，分子生物学的发展及其应用，为这方面的研究开辟了一条新的途径。我们通过对RT－PCR方法的特异性及灵敏度加以分析，在此基础上进行了干细胞移植富集血残存肿瘤细胞的检测工作。

　　1　材料与方法

　　1.1　样品

　　乳腺癌细胞系MCF－7、由CS－3000循环血分离所得淋巴细胞、用淋巴细胞稀释乳腺癌细胞使其浓度由1/10²至1/10⁶、15例行APBSCT（自体外周血干细胞移植）的乳腺癌患者的外周血干细胞。

　　1.2　RNA的提取

　　采用Trizol法制备总RNA，用Trizol（Gibco产品）裂解细胞后，加入氯仿并离心使之分为水相和有机相两层。转移RNA所在的水相，并用异丙醇沉淀RNA，经80％乙醇洗涤后用水（RNase free）溶解。制备的RNA样品用核酸定量分析仪检测OD260、OD260/OD280的值，并计算RNA产量。

　　1.3　RT－PCR

　　cDNA第一链的合成（Boehringer Mannheim产品）：使用20μl体系，主要包括以下成分：反应缓冲液、10mmol/LdNTP、1μgtotalRNA(0.1μgm RNA)、50U RNase inhibitor、50UAMV反转录酶、1.6μgoligo(dT)₁₅引物。于42℃反应30分钟，99℃5分钟终止反应。PCR(TaKaRa产品）：建立100μl的反应体系，主要成分如下：反应缓冲液、10mmol/LdNTP、引物（上、下游引物终浓度均为0.2μmol/L,引物序列见附表）、2～3μlcDNA产物、5UTaqDNA聚合酶。95℃10分钟预变性，反应40个循环，每循环94℃、60℃、72℃各1分钟，最后一个循环72℃保温10分钟。

附表　RT－PCR扩增中使用的引物序列

mRNA	产物(bp)	引物(5′→3′)
MUC1	288	CGTCGTGGACATTGATGGTACC 　　GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA
Keratin19	460	AGGTGGATTCCGCTCCGGGCA 　　ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA
β－actin	300	CTTCGCGGGGCGACGATGC 　　CGTACATGGCTGGGGTGTTG

　　1.4　琼脂糖凝胶电泳

　　1％琼脂糖凝胶（含0.5μg/mlEB）电泳，紫外灯下观察结果并照相。

　　2　结果

　　2.1　特异性

　　MUC1、K19基因在乳腺癌细胞系MCF－7中表达阳性，而在淋巴细胞中则未见表达（图1）。

1-淋巴细胞 2-MCF-7 3-PCR Meker

1　MUC1、K19、β－actin在乳癌细胞系MCF－7、淋巴细胞中的表达情况

　　2.2　灵敏度

　　通过细胞稀释检测该方法的灵敏度，在10⁷淋巴细胞中分别加入10⁵、10⁴、10³、10²、10¹乳腺癌细胞，前4组为阳性结果，证明当10⁷淋巴细胞中至少有102乳腺癌细胞时，RT－PCR方法可检测到，即该方法的灵敏度可达1/10⁵（图2）。

图2　用稀释法比较MUC1和K19基因的检测灵敏度

　　2.3　外周血干细胞移植富集血中残存病灶检测情况

　　15例乳腺癌患者中有2例检测结果为阳性(图3)。

图3　外周血干细胞中MUC1、K19、β－actin的表达情况

　　3　讨论

　　在自体外周血干细胞移植中，检测富集血中残存的肿瘤细胞，对阳性样品进行纯化，指导相应的治疗，以降低移植后的复发率，延长患者的生存期有重要意义。进行这方面的工作，无疑对检测方法提出了较高的要求。近几年，国外多应用RT－PCR方法检测淋巴结中肿瘤细胞的转移情况^[3～5]。而我们为找到一种有较高特异性的肿瘤生物标记，选用了MUC1、K19基因的表达情况作为检测指标。

　　因为是检测富集血中的残存肿瘤细胞，所以要求目的基因必须在乳腺癌细胞中表达，而在血细胞（主要是淋巴细胞）中不表达。我们采用了两个组织特异性标记－MUC1、K19，MUC1编码上皮粘蛋白，K19编码上皮角蛋白，二者均存在于目前已知的几乎所有类型的乳腺癌细胞中。在许多其它的上皮组织及其癌细胞中，亦可见MUC1和K19的表达，如肺癌、前列腺癌等。从我们已完成的实验也验证了这一点。乳腺癌细胞系MCF－7中MUC1和K19表达均为阳性，而在淋巴细胞中则未见表达。此外，要从大量的富集血淋巴细胞中检测出极微量的肿瘤细胞，对灵敏度有极高的要求。经本实验证明，用RT－PCR法对MUC1和K19的检测灵敏度可达1/10⁵。在这方面，RT－PCR较之传统的免疫组化等方法具有了更大的优越性^[6,7]。

　　在建立起较成熟的实验方法基础上，我们检测了15例乳腺癌患者干细胞移植富集血中的残存瘤细胞，有2例为阳性结果，至于其预后的效果尚待进一步的观察。

　　综上所述，RT－PCR是检测外周血干细胞富集血中残存瘤细胞的切实可行的方法，有助于提高移植的安全性，延长生存期。

　　作者单位：天津医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所免疫研究室(天津市300060）

参考文献

　　1 Laport GF,Grad G,Bitran JD,et al. High－ dose chemotherapy consolidation with autologous stem cell rescue(ASCR)in metastatic breast cancer. Bone Marrow Transplant,1998;21(2):127～ 32

　　2 Antaman K,Corringham R,de Vries E,et al. Dose intensive therapy in breast cancer. Bone Marrow Transplant,1992;10(Suppl 2):67

　　3 Noguchi S,Tomohiko A,Motomura K,et al. Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase－ polymerase chain reaction. Am J Pathol,1996;148:649～ 56

　　4 Datta YH,Adams PT,Drobyski WR,et al. Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse transcriptase－ polymerase chain reaction. J Clin Oncol,1994;12:475～ 82

　　5 Mori M,Mimori K,Inoue H,et al. Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by means of reverse transcriptase－ polymerase chain reaction. Cancer Res,1995;55:3417～ 20

　　6 Schoenfeld A,Luqmani Y,Smith D,et al. Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes of reverse transcriptase－ polymerase chain reaction. Cancer Res,1994;54:2986～ 90

　　7 Noguchi S,Tomohiko A,Motomura K,et al. Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph nodes by means of reverse transcriptase－ polymerase chain reaction. Cancer,1994;74:1595～ 600