CD/5－FC体系对人乳腺癌基因治疗作用的实验研究

　　中国肿瘤临床1999年第26卷第12期

吕焕章　吴德政　顾斌　万永玲　王嘉玺

　　摘　要　目的：探讨CD/5－FC体系对人乳腺癌的实验治疗作用。方法：应用MTT法测定人乳腺癌细胞对5－FC的敏感性。结果：实验显示，5－FC对导入CD基因的人乳腺癌细胞有明显的细胞毒作用，而对未导入CD基因的人乳腺癌细胞的毒性较低，5－FC对导入和未导入CD基因的人乳腺癌细胞的IC50分别为418μg/ml和1249μg/ml。结论：CD/5－FC体系对体外转基因的人乳腺癌细胞有一定的抗肿瘤作用。

　　关键词：基因治疗　乳腺癌　胞嘧啶脱氨酶　5－氟胞嘧啶

　　基因治疗为肿瘤治疗提供了一个新的治疗途径。药物敏感性基因（drug sensitivity gene）疗法或自杀性基因（suicide gene）疗法是肿瘤基因治疗的一个新策略^[1,2]。药物敏感性基因在肿瘤细胞表达后使原来没有抗肿瘤作用的前体药物在肿瘤局部转化为具有细胞毒作用的抗癌药物，从而选择性杀伤肿瘤细胞，达到抗肿瘤作用。胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）基因是一种重要的药物敏感性基因。本实验主要研究探讨CD/5－FC治疗体系对人乳腺癌的实验治疗作用，对该体系的肿瘤治疗作用初步的评价。为乳腺癌的治疗研究提供了一个新的方法和思路。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂和药物

　　RPMI1640与胎牛血清分别购自Gibco－BRL公司和中国医学科学院血液学研究所，二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶及溴化蓝四唑（MTT）为Fluka产品。5－氟胞嘧啶（5－fluorocytosine,5－FC）与5－氟脲嘧啶（5－fluororuacil,5－FU）分别购自Sigma公司和上海海普药业有限公司。

　　人乳腺癌细胞株MCF－7，转染pLCDSN的人乳腺癌细胞株MCF/CD，转染pLCDSN的人乳腺癌细胞株MCF/CD，本室克隆。

　　1.2　细胞培养

　　用含10％胎牛血清的RPMI－1640培养液，用0.25％胰蛋白酶消化、吹打细胞，制备细胞悬液，计数细胞并稀释为2×10⁴/ml，将细胞接种于96孔培养板，每孔接种2×10³个细胞。将细胞培养板置于37℃、5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱内培养。每天取三孔细胞进行测定，每孔加入MTT（5mg/ml）15μl，于37℃、5％CO₂培养箱内继续孵育4小时，弃掉培养液，加入150μl DMSO震荡，使成色产物完全溶解。

　　1.3　MTT法测定

　　用0.25％胰蛋白酶消化处于指数生长期的细胞，吹打分散细胞制成悬液，使用RPMI1640培养液稀释成2×10⁴/ml的细胞浓度，接种于96孔细胞增减板，每孔接种2×10³个细胞，于37℃、5％CO2饱和湿度孵箱内培养，次日依次加入不同浓度的5－氟胞嘧啶20μl，每个浓度设三个平行孔，空白对照组加入20μl RPMI1640培养液。将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2的饱合湿度孵箱内继续培养，7天后，每孔加入MTT（5mg/ml）15μl，再置孵箱内培养4h，快速翻转细胞培养板去掉培养液，每孔加入150μl DMSO，震荡，使有色产物充分溶解，用BIO－RAD450型酶标仪，测定570nm处的吸收度（OD值），按下式计算细胞存活率：

　　1.4　“旁观者杀伤效应”测定

　　制备细胞浓度为2×104/ml的细胞悬液，转基因细胞和未转基因细胞分别按照0:100、5:95、10:90、20:80、30:70、70:30、100:0的比例混合均匀，接种96孔细胞培养板，每孔接种2×103个细胞，置37℃、5％CO₂孵箱内培养，次日加入不同浓度的5－氟胞嘧啶20μl，空白对照组加入20μlRPMI1640培养液，继续培养7天后，按前述MTT法测定细胞存活率，将原始数据输入计算机，计算IC₅₀和进行回归分析。

　　1.5　统计分析

　　利用SAS统计软件进行ANOVA分析或协方差分析。

　　2　结果

　　2.1　转基因细胞的生长特性

　　从图1可以看出，细胞在第1～2天生长速度较慢，第3～6天细胞生长迅速，处于指数生长期，第6天细胞存活率达到峰值。MCF－7、MCF/CD、MCF/LX三种细胞的生长曲线基本一致，统计分析表明，三种细胞的生长特性没有显著性差异（图1，P＞0.05）。

图1　乳腺癌MCF－7细胞，MCF/LX细胞，MCF/CD细胞生长曲线

　　2.2　前体药物5－FC对转基因肿瘤细胞的细胞毒作用

　　应用MTT法测定5－FC对转基因肿瘤细胞存活率的影响。结果显示，5－FC对转基因的人乳腺癌细胞均有明显的细胞毒作用，随着剂量增加，作用逐渐增强，细胞死亡率逐渐增加，表现为明显的剂量信赖效应，而对未转基因的肿瘤细胞毒性较低（图2）。

图2　5－氟胞嘧啶对MCF－7细胞和MCF/CD细胞的细胞毒作用

　　根据量效关系，计算5－FC对转入CD基因的和未转基因肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50），结果显示5－FC对转基因的人乳腺癌细胞的IC50为418μg/ml，显著低于未转基因的人乳腺癌细胞（IC501249μg/ml），统计学分析有显著性差异（图3,P＜0.01）。表明5－FC对转入CD基因的肿瘤细胞的细胞毒作用较强，而对未转基因的肿瘤细胞毒性较低。2.3CD/5－FC体系基因治疗、化学治疗的“旁观者杀伤效应”

图3　5－氟胞嘧啶对MCF－7细胞和MCF/CD细胞的细胞毒作用的IC50值，P＜0.01

　　该体系对人乳腺癌的“旁观者杀伤效应”不明显（P＞0.05，图4）。

图4　5－氟胞嘧啶对MCF/CD和MFC－7不同比例的混合细胞的细胞毒作用

　　3　讨论

　　药物敏感性基因疗法或自杀性基因疗法是肿瘤治疗的一个新的策略。在所进行的肿瘤基因治疗临床试验中，包括肿瘤免疫基因治疗、抑癌基因治疗、反义基因治疗及药物敏感性基因疗法等，其中药物敏感性基因疗法是最有希望在肿瘤治疗中取得突破的基因治疗途径之一^[1～4]，因此越来越受到各国科学家的重视。

　　本实验中的CD基因是存在于大肠杆菌而不存在于哺乳类动物真核细胞的一种药物敏感性基因。CD基因在转基因的肿瘤细胞表达后，可以将对正常细胞毒性较低的前体药物5－FC转化为抗癌药物5－FU，从而阻断核酸代谢途径，抑制DNA合成，导致肿瘤细胞死亡。Mullen等发现，5－FC使转入CD基因的小鼠肉瘤和小鼠结肠腺癌的克隆形成率和3HTdR掺入率显著降低，表现出明显的细胞毒作用^[5]。Huber等也报道，5－FC对转入CD基因的人结肠癌细胞和裸鼠移植瘤有明显的抗肿瘤作用^[6]。本实验显示，5－FC在200～500μg/ml对人乳腺癌细胞具有明显的细胞毒作用，而对野生型的人乳腺癌细胞没有明显的杀伤作用。文献报道，5－FC一次腹腔注射500mg/kg，裸鼠体内的血药峰浓度可达到496μg/ml^[6]，证实上述体外实验的浓度在裸鼠体内是可以达到的。

　　药物敏感性基因/前体药物治疗体系在某些肿瘤的实验治疗中显示出“旁观者杀伤效应”，即前体药物不仅杀伤导入药物敏感性基因的肿瘤细胞，而且对转基因细胞附近的未转基因肿瘤细胞也表现出杀伤效应。Culver等发现，将转入HSV－tk基因的腺癌细胞或纤维肉瘤细胞与未转基因的野生型肿瘤细胞混合接种小鼠，当转基因的肿瘤细胞在混合细胞中仅占10％时，前体药物更昔洛韦即有明显的抗肿瘤作用，表明HSV－tk/更昔洛韦治疗体系对上述肿瘤细胞具有“旁观者杀伤效应”^[7]。Huber等报道，将转入CD基因的结肠癌细胞与未转基因的结肠癌细胞混合后接种裸鼠，当转基因的结肠癌细胞在混合细胞中仅占2％时，前体药物5－FC便有明显抗肿瘤作用，提示CD/5－FC治疗体系对结肠癌具有“旁观者杀伤效应”^[7]。然而，Mullen等报道，在体外实验中，5－FC对转基因的和未转基因的PA317混合细胞不存在明显的“旁观者杀伤效应”^[7]。然而本实验发现，在CD/5－FC体系对人乳腺癌的实验治疗的实验中，不存在明显的“旁观者杀伤效应”，结合文献报道^[5,8]，推测CD/5－FC体系的“旁观者杀伤效应”可能与细胞类型有关。

　　^＊本文课题受全军医药卫生科研基金资助

　　作者单位：吕焕章　吴德政　顾斌　万永玲　北京市北太平路医院临床药理科（北京市100039）

　　王嘉玺　北京市基础医学研究所

　　参考文献

　　1 Anderson WF.Human gene therapy.Science,1992;256:808

　　2 Miller AD.Human gene therapy comes of age.Nature,1992;357:455

　　3 Freeman SM,Whartenby KA, Freeman JL, et al. In situ use of suicide genes for cancer therapy. Semin Oncol,1996;23:31

　　4 彭朝晖，薛京伦，徐铃，等．基因治疗－基础与临床．北京：中国科学技术出版社，1994

　　5 Mullen CA,Kilstrup M,Blaese RM. Transfer of the bacterial gene for cytosine deaminase to mammalian cells confers lethal sensitivity to 5－ fluorocytosine:A negative selection system. Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:33

　　6 Huber BE,Austin EA,Good SS,et al. In vivo antitumor activity of 5－ fluorocytosine on human colorectal carcinoma cells genetically modified to express cytosine deaminase. Cancer Res,1993;53:4619

　　7 Culver KW,Ram Z,Wallbrdge S,et al. In vivo gene transfer with retroviral vector－ producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science,1992;256:1550

　　8 Huber BE,Austin EA,Richards CA,et al. Metabolism of 5－ fluorocytosine to 5－ fluorouracil in human colorectal tumor cells transduced with the cytosine deaminase gene: Significant antitumor effects when only a small percentage of tumor cells express cytosine deaminase. Proc Natl Acad Sci USA,1994;91:8302