nm23-H1与muc1基因在乳腺癌中的表达及其临床意义

　　第四军医大学学报1999年第20卷第9期

　　崔大祥　王岭　闫小君　苏成芝　王剑波

　　摘　要　目的：检测nm23-H1与muc1基因在乳腺癌中的表达水平，探讨nm23-H1与muc1在乳腺癌原发灶与转移灶中表达水平改变的临床意义．方法：采用定量RT-PCR与图像扫描定量分析技术检测22例家族性乳腺癌及60例散发性乳腺癌原发灶与转移灶中nm23-H1与muc1基因的表达水平．结果：①在22例有家族史的原发灶中,nm23-H1基因在10例无转移的标本中检出率为8/10，12例转移淋巴结中检出率4/12，癌旁组织中检出率为14/22；60例散发性乳腺癌中，nm23-H1基因在40例无转移的原发灶中检出率为34/40，20例转移淋巴结中检出率为7/20，癌旁组织中检出率为39/60；无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异（P＜0.01）；②nm23-H1基因在乳腺癌原发灶呈高表达，在转移灶中呈低表达，表达量在两者之间存在显著性差别（P＜0.001）；nm23-H1基因表达水平的高低与乳癌的分级、病理类型、家族史无关；③muc1在22例有家族史的无转移原发灶中检出率为2/10，转移淋巴结中检出率为10/12，癌旁组织中检出率为15/22；60例散发性乳腺癌中，40例无转移的原发灶中检出率为10/40，20例转移淋巴结中检出率为16/20，癌旁组织中检出率为45/60；无转移的原发灶与转移灶之间的检出率存在显著性差异（P＜0.01）；④muc1基因在乳腺癌原发灶中呈低表达，在转移灶中呈高表达，表达量在两者之间存在显著性差别（P＜0.01）;muc1基因表达与乳癌的分级、病理类型、家族史无关；⑤22例检出nm23-H1低表达的标本中20例检出muc1高表达．结论：nm23-H1低表达及muc1高表达与乳腺癌转移密切相关，检测nm23-H1与muc1基因的表达程度可能有助于判断乳腺癌是否转移；nm23-H1低表达与muc1高表达可能在乳癌转移过程中具有内在联系．

　　关键词：乳腺癌　nm23-H1　muc1　基因表达　定量RT-PCR

　　0　引言

　　乳腺癌是乳腺管上皮细胞恶性变而来，很容易转移到周围的淋巴系统中．乳腺癌分成两类，即遗传性乳腺癌与散发性乳腺癌．目前认为，乳腺癌的发生与遗传因素、内分泌因素、高脂肪饮食、酒精及病毒感染等有关．乳腺癌的转移与多种因素有关．nm23-H1是目前研究最多的转移抑制基因，muc1编码的蛋白是重要的乳癌相关抗原，但它们是否为乳癌转移的基因标志物，尚无定论．我们采用定量RT-PCR与图像扫描定量分析技术对22例家族性乳腺癌及60例散发性乳腺癌原发灶与转移灶进行研究，旨在探讨nm23-H1与muc1在乳腺癌原发灶与转移灶中基因表达异常的临床意义，为深入研究它们在乳癌转移中的作用奠定基础．

　　1　材料和方法

　　1．1　材料　①病例及标本：所有标本皆由西京医院提供并经病理H．E染色确诊，22例家族性乳腺癌及60例散发性乳腺癌原发灶与转移灶由西京医院王岭副教授提供．②nm23-H1与muc1质粒由本室保存．③nm23-H1与muc1引物运用网络上的站点www．williamstone．com/index．html软件进行设计．nm23上游引物为CCAACTGTGAGCGTACCTTC，下游引物为TCATAGATCCAGTTCTGACC，扩增片段长度为450bp；muc1上游引物为CGTCATGGACATTGATGGTACC，下游引物为GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA,扩增片段长度为228bp；对照β-actin引物为CACTGTGTTGGCGTACAG

　　gT与TCATCACCATTGCAATGAG，扩增长度为154bp．④反转录酶及Taq酶、dNTPs皆购自宝灵曼公司．⑤DOC-1000型图像扫描定量分析系统是BioRad公司产品．

　　1．2　方法^［1］　①RNA的提取：将组织剪碎后按异硫氰酸胍一步法提取总RNA并扫描定量．②mRNA反转录：10×RTbuffer2μL，10mmol/LdNTP2μL，随机引物2μL，RNasin1μL（20U/μL），无RNase水10μL，总RNA模板2μL（0.2μg/μL）混匀后，离心数秒，采用65℃5min，37℃60min，75℃5min，MMLV反转录酶在37℃10min时加入．③PCR扩增：取反转录产物2μL作模板，依次加入ddH₂O21μL，10×PCRbuffer3μL，2.5mmol/LdNTP3μL，上下游引物与β-actin引物各取1μL，Taq酶1．5U，混匀后，离心数秒，加入30μL石蜡油，采用94℃35s，55℃55s，72℃1min，35个循环，最后在72℃延伸7min．④结果判断标准：每次PCR扩增皆设立阳性、阴性对照，各取产物15μL进行10g/L琼脂糖凝胶电泳20min，EB染色，用DOC-1000型图像扫描定量分析系统对电泳分离出的片段进行扫描，获取相对A值，产物A值/β-actinA值比值＞1为高表达，＜1为低表达，=0为未检出表达；比值作为定量结果，运用t检验进行统计学处理．

　　2　结果

　　2．1　RT-PCR检测nm23与muc1基因的特异性　分别以β-actin作阳性对照，ras质粒作阴性对照，组织总RNA作模板，进行RT-PCR扩增，结果表明只有β-actin产物片段、nm23-H1与muc1产物片段出现，说明引物具有特异性(Fig1)．

图1　RT-PCR结果

　　fig1　Results of RT-PCR

　　1：Positive control；2：Negative control；3：Marker;

　　4：Production of muc1；5：Production of nm23．

　　2．2　定量RT-PCR检测nm23-H1结果　22例有家族史的原发灶中,10例无转移的标本中nm23检出率为8/10，12例转移淋巴结中检出率4/12，癌旁组织中检出率为14/22；60例散发性乳腺癌中，40例无转移的原发灶中检出率为34/40，20例转移淋巴结中检出率为7/20，癌旁组织中检出率为39/60．无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异（P＜0.01）,表达量在两组之间存在显著性差异（P＜0.01），表明检测nm23-H1有无表达异常对乳腺癌转移的判断具有重要意义．

　　2．3　定量RT-PCR检测muc1结果　22例有家族史的无转移原发灶中muc1检出率为2/10，转移淋巴结中检出率10/12，癌旁组织中检出率为15/22；60例散发性乳腺癌中，40例无转移的原发灶中检出率为10/40，20例转移淋巴结中检出率为16/20，癌旁组织中检出率为45/60．无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异（P＜0.01）,表达量在两组之间存在显著性差异（P＜0.01），表明检测muc1表达异常对乳腺癌有无转移的判断可能具有重要意义．

　　2．4　nm23-H1与muc1表达改变与乳腺癌病理类型　nm23-H1在侵润性小叶癌、粘液癌、小细胞未分化癌中检出率稍高，muc1在导管原位癌、官状腺癌中检出率稍高，但无统计学上的差异．

　　2．5　nm23与muc1表达改变与乳腺癌组织分级　在不同类型的乳腺癌中，肿瘤分化越差，nm23检出率越低，但分化好的Ⅰ级和Ⅱ级与分化差的Ⅲ级之间，无显著性差异；muc1在不同类型的乳腺癌中，肿瘤分化越差，检出率越高，但分化好的Ⅰ级和Ⅱ级与分化差的Ⅲ级之间，无显著性差异．

　　2．6　nm23-H1与muc1表达改变在乳腺癌中的关系　22例检出nm23-H1低表达或无表达的标本中20例检出muc1高表达，还有6例muc1高表达的标本中nm23-H1呈高表达，标本中nm23-H1的低表达与muc1高表达在两者之间存在一定的相关性（r=0．8869）．

　　3　讨论

　　乳腺癌是女性生殖系统中发病率最高的恶性肿瘤，易侵犯淋巴结与转移到腋窝等部位，临床对转移与非转移的患者治疗方法不一样．因此，寻找判断肿瘤有无转移的基因标志物对临床乳腺癌患者的诊断治疗具有重要的指导意义．

　　nm23基因是目前研究最多的转移抑制基因．nm23基因在分化良好的肿瘤中呈高水平表达，且nm23基因表达与淋巴结转移呈负相关，与患者无病生存期、整个生存期呈正相关^［2,3］．muc1基因是一个十分重要乳腺癌相关抗原基因，muc1基因选择性拼接可在腺癌细胞膜表面及胞浆表达mucin蛋白，而在正常乳腺细胞表达很弱或无．进一步研究表明，muc1基因的编码产物是十分重要的乳癌标志物^［4～6］．nm23基因与muc1基因是否与乳腺癌转移有关？是否为乳癌转移的重要基因标志物？目前未见文献报道．

　　本实验结果显示：22例有家庭史的无转移的10例乳腺癌原发灶中nm23-H1检出率为8/10，转移淋巴结中检出率为4/12，癌旁组织中检出率为14/22；60例散发性乳腺癌中，40例无转移的原发灶中检出率为32/40，转移淋巴结检出率为7/20，癌旁组织中检出率为45/60．无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异（P＜0.01），表明检测nm23-H1低表达异常对乳癌转移的判断具有重要意义；nm23-H1表达异常可能与乳癌家族史无关．22例有家族史的无转移的10例原发灶中muc1检出率为2/10，转移淋巴结中检出率为10/12，癌旁组织中检出率为15/22；60例散发性乳癌中无转移的原发灶中检出率为10/40，转移淋巴结中检出率为16/20，癌旁组织中检出率为45/60，无转移的原发灶与转移灶中的检出率存在显著性差异(P＜0.01)，表明muc1高表达与乳癌转移密切相关，检测muc1表达异常对乳癌有无转移的判断可能具有重要意义．进一步统计分析显示，nm23-H1与muc1表达改变与乳癌病理类型无关，与乳癌组织分级无显著相关．因此，nm23-H1基因与muc1基因可能是与乳腺癌转移有关的基因标志物，但特异性如何仍有待于进一步研究．

　　实验结果示：22例检出nm23低表达或无表达的标本中20例检出muc1高表达，表明nm23-H1与muc1可能存在内在联系．nm23-H1基因编码产物与二磷酸核苷激酶（NDPK）的α-链氨基酸序列高度相似，催化GTP→GDP转化，参与微管聚合及G蛋白介导跨膜的信号转导；其蛋白氨基酸顺序中含2个亮氨酸拉链结构，能促进蛋白二聚体形成，有利于碱性氨基酸区域与DNA结合．nm23-H1基因低表达可引起一系列编码产物减少，引起一序列信号转导异常，加速肿瘤细胞发生发展与移动^［7～9］．muc1基因编码的MUC1蛋白在乳腺瘤细胞膜及胞浆中高表达，其核心蛋白部分常缺乏糖基化，因此导致新的抗原表位置露或出现；MUC1还包含VNTR（Variable number of tandem repeats），是重要的免疫作用部位,MUC1胞浆结构域与包含GRB2蛋白的SH2相互作用，转导信号至ras，可引起细胞恶性转化．进一步研究表明，MUC1表达可降低beta-catenin与E-cadherin细胞粘附分子的结合，促进转移^［10,9］．总之，nm23-H1与MUC1基因通过编码蛋白的减少或结构异常可导致信号转导异常，加速乳腺细胞恶性转化，并降低转化的细胞与粘附分子地结合，促进癌变细胞转移．nm23-H1与muc1基因之间的内存联系，仍有待于深入研究．

　　总之，本研究表明，nm23-H1与muc1基因表达异常与乳腺癌转移相关，检测nm23-H1与muc1基因有无异常表达，可用于判断乳癌患者有无转移，对乳腺癌的治疗具有重要指导意义，但特异性如何仍有待于进一步研究．

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目　No．39470683

　　作者简介：崔大祥，男，1967-02-03生，安徽省桐城市人，汉族．生化与分子生物学博士，讲师，发表论文21篇．Tel：(029)3374771　E-mail　cuidx@igd．edu．cn

　　作者单位：（崔大祥　闫小君　苏成芝）第四军医大学：基因诊断技术研究所，

　　（王岭）西京医院普通外科，

　　（王剑波）西京医院病理科，陕西西安710033

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