乳腺癌MCF－7/Adr耐药细胞CD95分子的多态性表达和功能缺陷

癌症 2000年第4期第19卷 快速报道

作者：陈俊　张积仁　周殿元

单位：陈俊　张积仁（第一军医大学珠江医院肿瘤中心,广东　广州　510280）；周殿元（第一军医大学南方医院消化科，广东　广州　510515）

关键词：耐药细胞；MCF－7/Adr；CD95；分子多态性

　　【摘要】目的:观察MCF－7/Adr耐药细胞CD95分子的表达和功能及其与药敏细胞的差异,初步探讨CD95缺陷与多药耐药的潜在关系。方法:对乳腺癌MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞进行对比研究。流式细胞仪检测CD95蛋白水平，RT－PCR分析CD95mRNA转录体的多态性。碘化丙啶染色和DNA琼脂糖凝胶电泳观测抗CD95单克隆抗体对MCF－7/Adr耐药细胞的诱导凋亡效应。结果:MCF－7/Adr耐药细胞CD95阳性率为56.63％明显低于MCF－7药物敏感细胞株（阳性率为67.38％）；RT－PCR显示MCF－7/Adr耐药细胞CD95mRNA同时表达两种CD95转录体,一种为1009bp的结构正常的分子，另一种为0.7kb左右长度的可溶性CD95。MCF－7药物敏感细胞只表达膜型CD95一种分子;1.0μg/ml抗CD95McAb作用24小时,MCF－7药物敏感细胞的凋亡率为84.67％,而MCF－7/Adr耐药细胞的凋亡率仅为14.37％。结论:MCF－7药物敏感细胞和其MCF－7/Adr耐药亚系细胞在CD95分子多态性和介导凋亡功能上均存在显著差异，提示耐药细胞对CD95表达和功能的调控与药敏细胞有重要差异。

　　中图分类号：R737.902　文献标识码：A　文章编号：1000－467X（2000）04－0307－04

The deficiency of CD95（ APO-1/Fas） in expression and function on drug resistant cell line MCF-7/Adr

CHEN Jun　ZHANG Ji-ren

　　（Center of Oncology,Zhujiang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou,510280,P.R.China）

　　ZHOU Dian-yuan

　　（Nanfang Hospital, First Military Medical University,Guangzhou,510280,P.R.China）

　　【Abstract】 Objective： The status of CD95 expression and function in a drug resistant cell line MCF-7/Adr was investigated. Methods： CD95 protein was assayed by Immunofluorescence and flow cytometry analysis. Reverse transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) followed by Southern Blot was performed to analyzed the isoforms of CD95 mRNA transcripts. The anti-CD95-induced apoptosis was detected by DNA fragmentation assay and propidium iodide(PI)staining. Results： The expression rate of CD95 was 56.63％ on MCF-7/Adr and 67.38％ on MCF-7. RT-PCR revealed that two isoforms of CD95 mRNA transcripts including membraneisoform (mCD95) and soluble isoform (sCD95) was found to present in MCF-7/Adr simultaneously, however only one isoform, mCD95, was in MCF-7 cells. Anti-CD95 McAb induced MCF-7 but not MCF-7/Adr apoptosis rapidly. The apoptosis rate was 84.68％ in MCF-7 and 14.37％ in MCF-7/Adr after 24 hours treatment with 1.0μ g/ml anti-CD95 respectively.Conclusion:By comparison with parental cell MCF-7,the expression and function of CD95 on drug-resistant MCF-7/Adr are deficient severely. It suggests that the regulation mechanism of CD95 molecule in drug resistant cells differ from that in drug sensitive cells, CD95 deficiency maybe an important potential element involved in drug resistance.

　　Key words: CD95; Multidrug resistance; MCF-7/Adr

　　目前,化疗药物的主要作用机制均已基本明确,但化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的确切机理却尚不清楚。CD95(APO－1/Fas)和CD95L相互作用启动细胞内源凋亡程序，是一条独特的凋亡通路^[1,2]。新近的研究表明多种肿瘤细胞经阿霉素、顺铂、VP－16等不同作用机制的药物作用后CD95L或CD95的表达水平均明显增强,而CD95L的抑制剂抗CD95抗体的F(ab')₂可明显抑制化疗诱导的凋亡^[3～5]。这些报道表明激活CD95通路是化疗诱导肿瘤细胞凋亡的重要机制。肿瘤细胞多药抗药性的首要表现是细胞抵抗化疗诱导的凋亡^[6],因此探讨CD95通路与多药抗性发生的关系对于进一步深入了解多药抗性发生的机制具有重要的意义。但目前这方面的研究还少见报道。本研究对乳腺癌MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞的CD95表达和功能进行对比研究,以对上述问题进行初步探讨。

　　1　材料和方法

　　1.1细胞系和主要试剂

　　乳腺癌MCF－7/Adr耐药细胞系阿霉素低剂量逐级诱导产生的耐药亚系,对阿霉素耐药1000倍,并对顺铂,VP16等多种药物交叉耐药,抗药程度分别为几十至上百倍,其耐药机制主要为mdr1介导^[7,8]。MCF－7/Adr耐药细胞和其亲本系MCF－7药物敏感细胞均引自中国医科院药物所娄丽广博士。两者均于DMEM完全培养基(10％小牛血清,2mmol/L谷氨酰胺,青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)中贴壁生长,37℃、5％CO₂、100％湿度下培养至对数生长期进行实验。MCF－7/Adr耐药细胞在培养时加入10μmol/L的阿霉素以维持抗药性,实验前7天撤药。

　　抗人CD95McAb由德国癌症研究中心Prof.PH.Krammer惠赠。

　　1.2流式细胞仪检测CD95表达

　　胰酶消化MCF－7药物敏感和MCF－7/Adr耐药细胞,PBS清洗,调整细胞浓度为5×106/ml,细胞悬浮于50μl含0.1NaN3,2％新生牛血清的PBS中,加入1μg/ml抗人CD95McAb,或无关的鼠抗人IgG,4℃过夜,PBS清洗两遍后加入1∶5稀释的FITC－羊抗鼠,37℃,30min,彻底清洗后,上流式细胞仪FACScancytometer（BectonDickinson，MountainView，CA）进行检测,每份标本分析5,000细胞。

　　1.3RT－PCR与SouthernBlot

　　1×10⁶细胞经QuickpreptotalRNAextractionkit(Pharmacia产品)提取总RNA,取1μg总RNA进行逆转录,逆转录反应采用Ready－to－GoT－PrimedcDNAfirststrandsynthesiskit(Pharmacia产品)。2μl逆转录产物进行PCR扩增。经94℃30秒、58℃45秒、72℃70秒共38循环。取8μlPCR产物上样1.5％琼脂糖凝胶电泳,观察扩增片段,并将其转移至硝酸纤维膜。APO－1探针标记,杂交和显色采用地高辛标记显色试剂盒(宝灵曼)按说明进行。CD95引物设计参照文献^[9]:上游序列:5'－ATGCTGGGCATCTGGACCCT－3'(193－212),下游序列:5'－TCTAGACCAAGCTTAGGGTTTC－3'(1180～1201)。扩增片段长度1009bp。以PL430质粒扩增产物为阳性对照。内对照β－actin引物参照文献^[10]上游序列:5'－ACTAACTCATGAAGATCCTC－3',下游序列:5'－CAGGAGGAGCAATGATCTTGA－3'。经94℃40秒、55℃45秒、72℃60秒共38循环扩增片段长440bp。以上引物均由中科院上海生化所合成。

　　1.4碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)染色分析抗CD95McAb诱导的凋亡率

　　MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞以5×10⁵/孔密度一式三份分别植入24孔细胞培养板,12小时后换液,加入0.5ml含1.0μg/ml抗人CD95McAb的DMEM培养基,作用24小时后,胰酶消化细胞,70％冷乙醇固定30分钟,PBS洗一遍,加入PI荧光染液(50μg/mlPI,0.1％sodiumcitrate,RNaseA10μg/ml,0.1％tritonX－100)4℃黑暗中30分钟,上流式细胞仪FACScancytometer（BectonDickinson，MountainView，CA）分析DNA荧光强度,以亚G₁峰细胞为凋亡细胞,每份标本分析20,000细胞。

　　1.5DNA电泳检测凋亡

　　按文献^[11]进行。胰酶消化抗CD95McAb作用的MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞,离心收集细胞,PBS洗二遍,加入10倍细胞体积的裂解液(75mmol/LNaCl、Tris.HCl(pH8.0)、10mmol/LEDTA、0.5％SDS、0.15mg/mlProteinaseK)50℃3小时，13，000rpm，10分钟，取上清，等体积酚/氯仿抽提，加入十分之一体积3mol/LNaCl和两倍体积乙醇沉淀DNA，70％乙醇漂洗，凉干，加入50μl含100μg/mlRNaseA的TEbuffer，65～30分钟，然后上样于1.8％琼脂糖凝胶,60V,1小时,紫外灯观察结果。

　　1.6统计学处理

　　表达率比较采用两样本均数t检验。

　　2　结果

　　2.1MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感CD95表达的蛋白水平比较

　　图1显示CD95在MCF－7药物敏感和MCF－7/Adr耐药细胞的表达情况，本研究观察到MCF－7/Adr耐药细胞CD95表达率为56.63％，MCF－7药物敏感细胞CD95表达率为67.38％，两者相比较，MCF－7/Adr耐药细胞明显低于MCF－7药物敏感细胞，（P2.2MCF－7/Adr耐药细胞CD95的分子多态性表达

图1MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感CD95表达的蛋白水平

　　CD95mRNA在转录水平上存在多种剪接方式，可产生膜型和多种可溶性异型分子^[9]。我们运用RT－PCR分析了MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞CD95在转录水平上的差异。结果发现MCF－7/Adr耐药细胞同时扩增出两条片段,长度分别为1Kb和0.7Kb左右，1Kb片段与CD95质粒扩增片断大小一致，符合预期的完整的膜型分子的长度。而MCF－7药物敏感细胞仅扩增出一条片段,长度1Kb左右(图2a)。SouthernBlot证实0.7Kb片段和1Kb片段均为CD95分子(图2b)，根据已报道的文献，我们推测0.7Kb的片段为一种可溶性CD95异型分子。此结果表明MCF－7/Adr耐药细胞与MCF－7药物敏感细胞相比较存在CD95分子表达形式差异，MCF－7/Adr耐药细胞同时表达膜型和可溶型CD95，展示出CD95分子多态性。

图2aMCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感CD95mRNA转录体比较

　　lane1：marker;lane2:positivecontrolPL430plasmid；lane3:MCF－7；lane4:MCF－7/Adr。

图2bCD95mRNA转录体的分析Southernblot；lane1:1Kbmarkerlane2:MCF－7；lane3:MCF－7/Adr。

　　2.3MCF－7/Adr耐药细胞对CD95McAb的抵抗

　　为进一步明确CD95的多态性表达对MCF－7/Adr耐药细胞CD95通路的功能影响，我们用CD95McAb作用于MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞，观察细胞的增殖情况，CD95McAb(1.0μg/ml)作用24小时明显抑制了MCF－7药物敏感细胞的增殖,但对MCF－7/Adr耐药细胞无增殖抑制效应。经CD95McAb作用后,MCF－7药物敏感细胞的染色质DNA呈现梯状改变,表明发生了凋亡,而MCF－7/Adr耐药细胞染色质DNA则无此改变(图3)。流式细胞仪揭示MCF－7药物敏感细胞的凋亡率为84.68％，而MCF－7/Adr耐药细胞的凋亡率仅14.37％，和未作用时相似（图4）。表明MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞对CD95McAb的反应性差异显著,MCF－7药物敏感细胞为CD95敏感而MCF－7/Adr耐药细胞为CD95抗性。

图3抗CD95McAb作用对MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞基因组DNA的影响

　　lane1～2：MCF-7,1:control;2:CD95McAbat1.0μg/ml;Lane3～4:MCF－7/Adr,3:control;4：CD95McAbat1.0μg/ml。

图4抗CD95McAb诱导MCF－7/Adr耐药细胞和MCF－7药物敏感细胞凋亡的定量比较

　　Upper:MCF－7.bottom:MCF－7/Adr

　　3　讨论

　　CD95基因在mRNA水平上存在多种剪接形式,除产生结构完整的膜型分子外,还产生多种跨膜区及部分胞内区缺失的可溶型分子,膜型分子具有正常的介导凋亡功能而可溶型分子则拮抗膜型分子的作用,两类分子的比例变化是细胞对CD95通路功能进行自调控的主要方式^[8]。RT－PCR方法可同时检测到CD95的包括膜型和可溶型在内的多种转录剪接变异体,是分析CD95分子多态性的重要方法^[9]。先前的研究表明可溶型CD95集中表达于多种自身免疫性疾病病人的T细胞上，其生物效应为抑制针对自身抗原的T细胞的自杀或他杀，是自身免疫性疾病发生的重要原因^[5]。但目前可溶型CD95在肿瘤细胞，尤其是耐药肿瘤上的表达和效应尚不清楚，尚未见相关文献报道。本研究报道了可溶型CD95在MCF－7/Adr耐药细胞上表达，我们推测可溶型CD95的表达与MCF－7/Adr耐药细胞的CD95抗性有紧密联系。

　　激活CD95通路(上调CD95L和或CD95表达)是化疗药物诱导多种肿瘤凋亡的重要机制,肿瘤细胞CD95L、CD95的表达水平和可否被诱导表达是药物诱导凋亡的关键因素^[3～5]。Friesen等^[12]报道CD95抗性肿瘤对化疗产生一定的抵抗，CEM耐药细胞在CD95表达和化疗对CD95L诱导上均存在缺陷。提示CD95缺陷与抗药的发生具有潜在的关系。我们发现尽管MCF－7药物敏感细胞和MCF－7/Adr耐药细胞均表达CD95,但两者在表达的分子形式上存在明显差异,前者仅表达膜型分子而MCF－7/Adr耐药细胞则表现为多态性，同时表达膜型和可溶型分子,这一差异尚未见类似报道。在功能上CD95McAb可抑制MCF－7药物敏感细胞增殖并诱导之凋亡,表明MCF－7药物敏感细胞不但CD95分子完整,其胞内CD95通路亦保持通畅。而MCF－7/Adr耐药细胞则抵抗CD95McAb。我们推测MCF－7/Adr耐药细胞的CD95抵抗至少部分是CD95可溶型分子拮抗的结果。药物敏感亲本系和耐药亚系在CD95分子多态性和功能上的显著差异提示在耐药状态下细胞对CD95的分子调控发生变化。本室在前期工作曾用切割mdr1mRNA的Ribozyme阻断MDR1表达,对MCF－7/Adr耐药细胞的抗药性只获得部分逆转^[9]。提示还可能存在其它机制参与MCF－7/Adr耐药细胞的耐药发生。因此MCF－7/Adr耐药细胞CD95调控改变导致的CD95功能缺陷究竟与mdr1基因有着怎样的关系，其在多药抗性发生中的具体作用如何？这些问题还有待进一步研究。

　　通讯作者:张积仁　Tel:86－20－85143478　Fax:86－20－85143478　E－mail:gzzhjr@public.guangzhou.gd.cn

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收稿日期:1999－09－02

　　修回日期:2000－01－24