乳腺癌及其癌前病变中细胞凋亡与p53、bcl－2蛋白的表达

中国肿瘤临床 2000年第5期第27卷 论著

作者：李龙山　孙东植　孙抒　金昌范

单位：李龙山（延边大学医学院病理学教研室　吉林省延吉市133000）；孙东植（延边大学医学院病理学教研室　吉林省延吉市133000）；孙抒（延边大学医学院病理学教研室　吉林省延吉市133000）；金昌范（延边大学医学院病理学教研室　吉林省延吉市133000）

关键词：乳腺癌细胞凋亡p53bcl－2

　　摘要　目的：通过观察乳腺癌及其癌前病变中细胞凋 亡和凋亡调控基因p53、bcl－2的表达，探讨细胞凋亡与 凋亡调控基因在乳腺组织恶性转化进程中的作用。 方法：利用DNA缺口末端标记技术和免疫组织化学染色 ，原位观察31例乳腺癌，20例乳腺不典型增生和20例乳 腺单纯性增生中细胞凋亡和p53、bcl－2蛋白的表达，以 8例正常乳腺组织作为对照。结果：乳腺不典型增生 和单纯性增生中细胞凋亡指数显著高于乳腺癌及正 常乳腺组织(P＜0.01)，乳腺癌中细胞凋亡指数高于正常 乳腺组织(P＜0.05)。乳腺癌和乳腺不典型增生中p53蛋白 阳性率分别高于正常乳腺组织(P＜0.05)。凋亡细胞多 分布在p53、bcl－2蛋白阴性区，阳性区仅有少量分布， 且p53、bcl－2蛋白阴性组细胞凋亡指数高于阳性组(P＜ 0.05)。结论：细胞凋亡调控失调在乳腺组织恶性转化 进程中起重要的作用。突变型p53、bcl－2蛋白可抑制细 胞凋亡。

Expression of Apoptosis and p53, bcl－ 2 Protein in Breast Cancer and Its Precancerous Lesions

Li Longshan Sun Dongzhi Sun Shu

　　（Department of Pathology, Medical College of Yanbian University, Yanji ）

　　Abstract Purpose: To investigate the effects of apoptosis and its regulating genes in malignant transformation of breast cancer and its precancerous lesions. Methods: The expression of apoptosis and the positive expression of p53, bcl－ 2 proteins were observed in 31 cases of breast cancer in situs, 20 breast dysplasia and 20 breast hyperplasia by using DNA nick end labeling (TUNEL) technique and immunohistochemical staining . Eight normal breast tissues were used as control. Results: The apoptotic indexes in breast dysplasia and breast hyperplasia were significantly higher than those in breast cancer and normal (P＜0.01). The apoptotic index in breast cancer was higher than those in normals (P＜ 0.05). The positive expression rate of p53 protein in breast cancer and dysplasia were higher than that in normal control (P＜ 0.05). The majority of apoptotic cells were located in the negative expression area of p53, bcl－ 2 proteins, a few of apoptotic cells were located in the positive area. The apoptotic index in negative group of p53, bcl－ 2 proteins was higher than that in positive group (P＜ 0.05). Conclusion: The abnormal regulation of apoptosis may play an important role in malignant transformation of breast cancer,and p53, bcl－ 2 proteins may inhibit apoptosis.

　　Key Words Breast cancer Apoptosis p53 bcl－ 2

　　目前认为肿瘤的发生、发展不仅与癌基因突变，抑癌基因失活有关，而且与细胞凋亡调控失调有密切 关系。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，与其 他恶性肿瘤一样，其形成与发展是多步骤渐进、多种因素综合作用的结果。本实验运用免疫 组织化学和DNA缺口末端标记（TdT－mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）技术原位观察乳腺癌及其癌前病变中细胞 凋亡与凋亡调控基因p53、bcl－2等的表达，并探讨其在 乳腺组织恶性转化进程中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　收集我院附属医院病理科1996～1997年间乳腺手术标本 存档蜡块71例，其中乳腺癌31例，年龄25～77岁，平均 50.8岁；乳腺不典型增生20例，年龄21～46岁，平均35.5岁 ；乳腺单纯性增生20例，年龄15～45岁，平均28.4岁。另 选正常乳腺组织8例做对照观察。全部标本均经10％中 性福尔马林固定，石蜡包埋，5μm厚连续切片。

　　1.2　试剂

　　1.2.1　p53、bcl－2蛋白均为SantaCruz公司产品。S－P试剂盒 系ZYMED公司产品。

　　1.2.2　原位细胞凋亡检测试剂盒为德国宝灵曼公司产 品，该试剂盒由末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、标记缓 冲液（TdT buffer）和碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体（ Converter－AP）组成。

　　1.3　方法

　　1.3.1　TUNEL染色实验操作按宝灵曼公司试剂盒说明书进 行，其步骤如下：1)石蜡切片脱蜡至水。2)3％H₂O₂、甲醇，37℃，10分钟。3)5μg/ml蛋白酶K消化液作用15分钟。 4)蒸馏水洗5分钟，2次。5)标记液（TdT50μl＋TdTbuffer450μl） 作用，37℃，60分钟。6)PBS洗5分钟，2次。7)碱性磷酸酶 标记的抗荧光素抗体，37℃，孵育30分钟。8)PBS洗5分钟 ，2次。9)BufferⅢ洗5分钟，2次。10)NBT/BCIP显色15分钟。 11)BufferⅣ洗5分钟，2次。12)逐级脱水、透明、中性树胶 封片。

　　1.3.2免疫组织化学染色实验操作按S－P试剂盒说明书 进行，并略加修正。其步骤如下：1)石蜡切片脱蜡至 水。2)3％H2O2、甲醇、37℃，10分钟。3)PBS洗5分钟，3次。 4)微波抗原修复。5)10％羊血清20分钟。6)加一抗（工作 浓度p53、bcl－2为1:50）4℃，过夜。7)PBS洗5分钟，3次。8)加 二抗（工作浓度1:200），37℃，20分钟。9)PBS洗5分钟，3次 。10)加三

　　抗（工作浓度1:200），37℃，20分钟。11)PBS洗5分钟，3次 。12)DAB显色。13)流水充分冲洗。14)逐级脱水、透明、 中性树胶封片。

　　1.3.3免疫组织化学染色中以已知阳性的乳腺癌组织 切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照；TUNEL染 色中以已知阳性的肝脏组织切片作阳性对照，以不 含转移酶的标记缓冲液代替标记液作阴性对照。

　　1.4　结果判断

　　1.4.1细胞凋亡阳性物质呈紫蓝色，位于细胞核内， 阴性区域不着色；p53阳性物质呈棕黄色，位于细胞核 内；bcl－2阳性物质呈棕黄色，主要位于胞浆内，细 胞膜和核膜也少量着染。

　　1.4.2结果判断标准p53、bcl－2蛋白表达强度根据阳性 物质着色深浅及阳性细胞数的多少分为4级：无阳性 细胞或阳性细胞＜10％或背景同空白对照者为“－”；每张切片 仅有＜25％的细胞明显阳性为“＋”；25％～50％细胞明显呈阳 性为“＋＋”；＞50％细胞呈阳性为“＋＋＋”。

　　1.4.3细胞凋亡指数的测定（apoptotic index,AI）：每张切片 选择10个阳性染色最明显的高倍视野（×400），计数1 000个肿瘤细胞中阳性细胞所占的百分比。

　　1.5　统计学处理

　　细胞凋亡指数用t检验进行统计学处理；p53、bcl－2蛋 白阳性率的比较用χ2检验进行统计学处理。

　　2　结果

　　2.1　乳腺癌及其癌前病变中细胞凋亡的表达

　　细胞凋亡在所有组织切片中均可见到。正常乳腺组 织中凋亡细胞多位于乳腺导管及腺泡的上皮层；单 纯性增生中凋亡细胞多位于增生的导管和腺泡的上 皮层，弥漫性分布；不典型增生和单纯性增生一样 ，凋亡细胞多位于增生的上皮层，弥漫分布；乳腺 癌中凋亡细胞散在分布（图1）。乳腺癌及其癌前病 变中细胞凋亡的表达见表1。

图1　乳腺癌中细胞凋亡的表达TUNEL×400

表1　乳腺癌及其癌前病变中细胞凋亡的表达(±s)

　　*与正常乳腺组织比较P＜0.05,**与正常乳腺组织 比较

　　P＜0.01,▲▲与乳腺癌比较P＜0.01

　　2.2　乳腺癌及癌前病变中p53蛋白表达及其与细胞凋亡的关系

　　p53蛋白在乳腺癌及癌前病变中均有表达，且其阳性 表达强度及表达率随着乳腺组织恶性转化逐渐升高 。结合细胞凋亡进行观察，发现凋亡细胞多分布在 p53蛋白阴性区，而阳性区仅有少量分布。乳腺癌（图2）及癌前病变中p53蛋白表达及其与细胞凋亡的关系 见表2，3。

图2　p53蛋白在乳腺癌中的表达S－P×400

表2　乳腺癌及其癌前病变中p53蛋白的表达

　　*与正常乳腺组织比较P＜0.05

表3　乳腺癌及其癌前病变中p53蛋白表达

　　与细胞凋亡的关系(±s)

　　*与p53蛋白阳性组比较P＜0.05

　　2.3　乳腺癌及癌前病变中bcl－2蛋白表达及其与细胞凋亡的关系

　　bcl－2蛋白在乳腺癌及癌前病变中均有表达，且其阳 性表达强度及表达率随着乳腺组织恶性转化逐渐下 降。结合细胞凋亡进行观察，发现bcl－2蛋白阳性区 与bcl－2蛋白阴性区相比凋亡细胞显著减少。乳腺癌 （图3）及癌前病变中bcl－2蛋白表达及其与细胞凋亡 的关系见表4，5。

图3　bcl－2蛋白在乳腺癌中的表达S－P×400

表4　乳腺癌及其癌前病变中bcl－2蛋白的表达

表5　乳腺癌及其癌前病变中bcl－2蛋白表达

　　与细胞凋亡的关系

组织类型	bcl－2(＋)		bcl－2(－)
	例数	凋亡指数(±s)	例数	凋亡指数(±s)
乳腺癌	24	0.12±0.10	7	0.23±0.11*
不典型增生	17	0.38±0.14	3	0.36±0.04
单纯性增生	18	0.33±0.07	2	0.33±0.01
正常乳腺组织	8	0.06±0.02	—	—

　　*与bcl－2蛋白阳性组比较P＜0.05

　　3　讨论

　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年 约有120万妇女发生乳腺癌；有50万左右妇女死于本癌 。乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，但其病因目前 尚未完全阐明。

　　3.1　乳腺癌及其癌前病变中细胞凋亡的表达

　　细胞凋亡是恶性肿瘤普遍的自发现象^[1]。研究结果 表明，无论是肿瘤的发生、发展，还是治疗及预后 ，均与细胞凋亡有密切关系^[2～4]。乳腺是女性激素 作用的靶器官，乳腺组织恶性转化是多步骤渐进、 多因素综合作用的结果。众多学者们认为乳腺癌的 发生、发展可分为以下几个阶段：正常乳腺→单纯性 增生→不典型增生→原位癌→浸润癌。从本实验中 观察到，在上述各个阶段细胞凋亡有如下变化规律 ：随着乳腺组织增生，凋亡细胞增多，不典型增生 时凋亡细胞数达到高峰，而至乳腺癌时却显著下降 。从这一变化规律推测，乳腺单纯性增生和不典型 增生中机体启动凋亡机制淘汰过度增生的细胞和具 有突变倾向的细胞，从而尽可能地防止过度增生及 恶变。但当凋亡机制受各种因素的影响减弱甚至丧 失时细胞得以逃脱凋亡，使局部组织细胞继续增生 ，最终形成乳腺癌。

　　3.2　p53蛋白在乳腺癌及癌前病变中的表达及其与细胞 凋亡的关系

　　p53基因是一种抑癌基因，自Crawford等于1982年首次报道 p53基因与人乳腺肿瘤有关以来，对p53基因与乳腺癌的 关系进行了较详细的研究，取得了一定的进展。左 连富等研究发现突变型p53蛋白表达者乳腺癌组织分化 差，恶性度高，且与术后早期死亡有关^[5]。不仅如此 ，近年来的研究表明p53基因与细胞凋亡显著相关：突 变型p53基因抑制细胞凋亡，产生耐药性，而野生型p53基 因则诱导细胞凋亡，抑制耐药性^[6]。但也有与此相反 的研究结果，Zheng等认为p53基因与细胞凋亡无关^[7]。本 研究结果表明，p53蛋白表达随乳腺组织恶性转化逐渐 升高，在乳腺癌及乳腺不典型增生中其阳性表达率 高于正常乳腺组织。由于野生型p53蛋白半衰期短，故 免疫组织化学所测到的p53蛋白均属于突变型p53。由此 可见突变型p53蛋白过表达与乳腺癌发生有密切关系。 结合细胞凋亡进行观察，发现凋亡细胞多分布在p53蛋 白阴性区，而p53蛋白阳性区仅有少量凋亡细胞；而且 p53蛋白阴性组细胞凋亡指数高于p53蛋白阳性组。说明 突变型p53蛋白不仅参与细胞凋亡的调控，而且抑制细 胞凋亡。

　　3.3　bcl－2蛋白在乳腺癌及癌前病变中的表达及其与细 胞凋亡的关系

　　bcl－2是目前公认的抗凋亡基因。研究结果表明bcl－ 2基因对细胞的作用是抑制各种形式的细胞凋亡，使 细胞寿命延长[8]。因此理论上bcl－2基因表达越强，肿 瘤恶性程度越高，其病理生物学特性越差。然而许 多学者的研究结果表明bcl－2基因的表达往往与好的 生物学特性相关，即bcl－2基因在正常乳腺组织中呈 强阳性表达，并且随着乳腺组织恶性转化其阳性表 达下降。本实验中bcl－2蛋白在正常乳腺组织、单纯 性增生、不典型增生及乳腺癌中均表达较高的阳性 率，且呈正常乳腺组织中阳性率最高，随着乳腺组 织恶性转化其表达逐渐下降的趋势。这一结果表明 bcl－2蛋白表达降低与乳腺组织恶性转化有一定关系 。结合细胞凋亡进行观察，发现凋亡细胞多分布在 bcl－2蛋白阴性区，bcl－2蛋白阳性区无或仅有个别凋 亡细胞；而且bcl－2蛋白阴性组的细胞凋亡指数高于 bcl－2蛋白阳性组，说明bcl－2蛋白对细胞凋亡起抑制 作用。这一结果与Knowlton等的研究结果基本一致[9]，即 bcl－2基因抑制细胞凋亡，却与好的病理生物学行为 有关。Knowlton在解释这一现象时认为，bcl－2基因不仅 抑制细胞凋亡，而且还延长细胞周期，由此延缓肿 瘤细胞增殖，因此bcl－2基因高表达时其总的结果与 好的病理生物学行为有关。

(范锡凤校对)

　　本文课题受吉林省卫生厅科研基金资助

　　参考文献

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　　8，Colombel M,Symmaus F,Gil S,et al. Detection of the apoptosis－ suppressing oncoprotein bcl－ 2 in hormone－ refractory human prostate cancers. Am J Pathol,1993;143:390～ 400

　　9，Knowlton K,Mancini M,Creason S, et al.bcl－ 2 slows in vitro breast cancer growth despite its antiapoptotic effect. J Surg Res,1998;76(1):22～ 6

(1999－07－23收稿)