耐三苯氧胺大鼠乳腺癌细胞株的特性

中华肿瘤杂志 1999年第2期第0卷 简　报

作者：严航　尹科祥　苏宁

单位：210009 南京铁道医学院病理教研室

　　乳腺癌为妇女高发癌。而三苯氧胺(TAM)是临床乳腺癌内分泌治疗中重要的抗雌激素药物之一，长期用药可导致耐药性的产生。为进一步探讨TAM的耐药机制，了解耐TAM乳腺癌细胞的生物学特性，我们应用改良的Hug′s双层琼脂培养法，通过逐步提高TAM的浓度，对SHZ-88细胞进行克隆培养，建立了一株耐受TAM的大鼠乳腺癌细胞株，并对其生物学特性进行了研究。

　　材料与方法　耐药细胞株采用改良双层琼脂培养法，用含20%新生牛血清(FBS)的双倍RPMI 1640与等体积的1%琼脂混合，加入终浓度为10^-6mol/L的TAM，取1 ml该混合液置于3.5 cm的塑料6孔板中，此即底层琼脂。37℃含20%FBS的双倍RPMI 1640与等体积的37℃ 0.6%的琼脂混合，随后加入用少量培养液稀释的细胞悬液(经调整，细胞终浓度为10⁴/ml)，并加入与底层琼脂中相同浓度的TAM，此即上层琼脂。将制备好的琼脂培养板放置于湿化的CO₂培养箱中培养。最后进行耐药细胞株的筛选。细胞形成克隆后，于倒置显微镜下观察，用灭菌毛细滴管将边界清楚、细胞生长较佳的克隆转移到24孔板中培养。融汇后用胰蛋白酶(含EDTA)消化，制成悬液转移到6孔板中培养，最后用T-25玻璃培养瓶行扩展培养。上述扩展培养过程中所用FBS均为10%DCG-FBS(葡聚糖包裹活性碳处理的新生牛血清)，并含有终浓度为10^-6mol/L的TAM扩展培养后的细胞。再用2×10^-6mol/L的TAM进行克隆和扩展培养。方法和步骤均同上。

　　结果　耐药细胞株的生长增殖，倍增时间为40小时，而原代细胞倍增时间为22小时。5×10^-6mol/L的TAM对耐药细胞的克隆形成无明显的抑制作用(P＞0.05)，而10^-6mol/L的TAM对原代细胞克隆形成有明显的抑制作用(P＜0.001)。10^-6mol/L的TAM对SHZ-88细胞的³H-TdR渗入具有明显的抑制作用(P＜0.01)，而耐药细胞对其敏感性则大大降低，只有TAM的浓度达到10^-5mol/L时才表现有抑制前体渗入的作用(P＜0.01)。倒置相差显微镜下观察，见耐药细胞体积较原代细胞小，融汇前的细胞以细长型为主，细胞贴壁缓慢，贴壁后细胞多数呈双极式树突状生长，少数细胞呈三角形，或多角形不规则方式生长。细胞贴壁多数不牢固。HE染色显示，耐药细胞体积较小，大部分呈长梭形，且多有树突状突起，细胞间有空隙，偶见多角形或正方形细胞聚成癌细胞团块，细胞核及核浆比较大，核异型性更明显，且多有双核，甚至3～5个核，核仁清晰可辨，多为2～5个，偶有更多者，核分裂相多见，并可见病理性核分裂相。透射电镜下见耐药细胞面积较小，核仁清晰可见。多为2～3个，胞浆中线粒体较少，空泡结构减少，其余细胞器无明显变化，核糖体含量较丰富，细胞周边的微绒毛数量明显减少，直径较小，长度较短，细胞之间无明显的紧密连接及桥粒。扫描电镜见耐药细胞生长较松散，细胞多呈细长形，往往有1～2个较长的树突状突起。细胞面积小，细胞表面微绒毛明显减少，且微绒毛较短，较细，甚至有的细胞表面呈光滑状。

　　讨论　耐TAM乳癌细胞株的建立及培养有助于阐明药物的耐受机理，也有助于积极地寻找和筛选有效的抗耐药肿瘤的药物。我们应用改进的双层琼脂克隆方法，将药物TAM置于双层琼脂中，使原来对TAM敏感的原代细胞产生耐药。本研究建立的耐TAM大鼠乳癌细胞株，对TAM敏感性降低，与原代敏感的细胞相比，降低大约10倍。耐药细胞株的建立，不仅有助于在体外对TAM的耐药机理进行阐明，而且也有助于研究耐TAM的乳腺癌的体外生物学行为，为今后寻找及筛选抗耐TAM的乳腺癌药物提供了重要的实验模型。

(收稿：1998-01-14　　修回：1998-02-20)